[发明专利]一种基于ddPCR检测CRISPR/Cas诱导的基因突变和基因编辑频率的方法

说明书

本发明提供了一种基于ddPCR检测CRISPR/Cas诱导的基因突变和基因编辑频率的方法。所述方法包括根据CRISPR/Cas靶序列的突变位置，设计一对变异位点特异性PCR扩增引物和变异位点特异性探针，以及一对内源参考基因特异性PCR扩增引物和内源参考基因特异性探针；其中，所述变异位点特异性探针设置在突变位点区域，并且探针的5’端位于PAM区且连接有第一荧光基团，3’端连接有第一淬灭基团；所述内源参考基因特异性探针的5’端连接有第二荧光基团，3’端连接有第二淬灭基团。所述方法对于基因突变检测灵敏度高，对基因编辑频率的检测下限(LOD)更低，更接近预期的编辑频率值。

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，尤其是涉及一种基于ddPCR检测CRISPR/Cas诱导的基因突变和基因编辑频率的方法。

背景技术

CRISPR/Cas系统已被广泛应用于生物体基因组编辑和其他靶向修饰。与传统的农杆菌介导的T-DNA转基因方法相比，农杆菌介导法依赖于植物的随机重组或整合，由Cas核酸酶产生的位置特异性双链断裂(double-strand break,DSB)，主要通过容易出错的非同源末端连接(NHEJ)机械进行修复。修复的结果是可能导致各种替换、插入或缺失(indels)突变，最常见的是只有1bp变异的缺失突变。

目前已报道了几种检测CRISPR/Cas系统诱导的靶基因突变的方法，包括基于聚合酶链反应(PCR)的检测、T7核酸内切酶I识别切割、高分辨率熔融曲线分析(high-resolution melting，HRM)和基于NGS的方法。但这些方法都是半定量的，很难检测到含有低初始浓度DNA的加工食品样品中的变异，而且也难以精确量化基因编辑频率。此外，对于复杂的多倍体植物基因组中非常低频率的突变，现有的方法也难以很好地检测。

微滴式数字PCR(ddPCR)是一项突破性的技术，它依赖于将单个扩增分为不同的隔间，并检测其末端扩增产物。它提供超灵敏和绝对的核酸定量，没有标准曲线。到目前为止，几乎很少有关于ddPCR技术检测基因编辑植物及其衍生的加工食品相关报道。

鉴于，提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于ddPCR检测CRISPR/Cas诱导的基因突变和基因编辑频率的方法。解决了现有技术难以定量检测CRISPR/Cas诱导的植物基因突变以及难以准确量化植物基因编辑频率的技术问题。

本发明提供的技术方案如下：

一种基于ddPCR检测CRISPR/Cas诱导的基因突变的方法，所述方法包括：

根据CRISPR/Cas靶序列的突变位置，设计一对变异位点特异性PCR扩增引物和变异位点特异性探针，以及一对内源参考基因特异性PCR扩增引物和内源参考基因特异性探针；

其中，所述变异位点特异性探针设置在突变位点区域，并且探针的5’端位于PAM区且连接有第一荧光基团，3’端连接有第一淬灭基团；所述内源参考基因特异性探针的5’端连接有第二荧光基团，3’端连接有第二淬灭基团。所述第一荧光基团和所述第二荧光基团不同。

变异位点特异性PCR扩增引物设计跨越突变位点。使用普通PCR筛选引物，确定可以扩增单一的，片段大小正确的产物。CRISPR/Cas9诱导的突变是可预测的，大多数突变发生在原间隔基序邻接基序(PAM)5’端上游的3个碱基处。变异位点特异性探针应位于PAM区。为了保持探针对突变的敏感性，最好将PAM区标记为探针的5’端。

内源性参考基因是已验证的参考基因，内源性参考基因的检测区域不含基因编辑的突变位点，所选择的内源性参考基因拷贝数需要与所编辑的目标基因拷贝数在该植物样本中相同。基因编辑引起的突变将会导致变异位点特异性探针无法与目标序列结合，但不会影响内源性参考基因探针的结合，变异位点特异性探针主要用来评估突变基因的数量，而内源性参考基因特异性探针主要用来分析样本中的等位基因总数量。