[发明专利]扩增和确定目标核苷酸序列的方法

说明书

提供一种扩增和确定目标核苷酸序列的方法。所述扩增目标核苷酸序列的方法包括：将第一接合器及第二接合器分别连接至具有目标核苷酸序列的双股核酸分子的两端，以形成核酸模板，其中第一接合器包括Y型接合器或发夹型接合器，且第二接合器为发夹型接合器。接着，对核酸模板进行PCR扩增循环，以得到目标核苷酸序列的PCR扩增子。

技术领域

本发明是涉及一种基因体学的方法，且特别是涉及一种扩增和确定目标核苷酸序列的方法。

背景技术

经过十多年的技术发展，下一代测序(Next Generation Sequencing,NGS) 的成本大幅降低，加上大数据分析能力的迅速演进，因此多国大量推动精准医疗，而使庞大商机逐渐成形。在精准医疗中，“及早发现疾病的变化”为诊断治疗的重要依据及指标。尤其在癌症的发展过程中，DNA突变可能造成抗药性等不利于病人的情况，因此若能在初期发生即能侦测之，即可帮助医疗团队做出对病人最好的处置措施。

举例来说，在人体约2万个基因中，有大约300多个基因与癌症有高度相关，患有同一种癌症的病友，基因突变点也不尽相同。因此，即使是同一个癌症期别，施以同种药物的效果也大相径庭。如果能利用类似「全方位癌症基因检测」(Comprehensive GenomicProfiling)的方法，不分癌别地，一次针对300个基因进行检测，将所有突变一次找出来，为病人配对合适的治疗方案，可预期将能有效节省宝贵的时间与金钱。此外，不再以癌症种类与期别区分，而是检视基因突变并给予治疗，这也是「精准医疗」的精神所在。

然而，传统NGS的错误率约为1％，在最佳情况下可低至0.1％，但仍无法满足「检测低量变异基因」的需求，因此，发展一更准确的NGS方法仍为精准医疗领域的重要课题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种扩增目标核苷酸序列的方法，其所得到的扩增子在任一股中具有顺向目标核苷酸序列及反向目标核苷酸序列。

本发明的目的在于提供一种确定目标核苷酸序列的方法，其可得到互补两股DNA的序列信息。

为达上述目的，本发明提出一种扩增目标核苷酸序列的方法，其包括以下步骤。(a)将第一接合器及第二接合器分别连接至具有目标核苷酸序列的双股核酸分子的两端，以形成核酸模板，其中目标核苷酸序列包含顺向股与反向股，第一接合器包括Y型接合器或发夹型(hair-pin)接合器，且第二接合器为发夹型接合器。(b)将核酸模板进行变性反应。(c)在足以对目标核苷酸序列进行聚合酶链反应(PCR)扩增的条件下，使第一引物、第二引物、DNA 聚合酶与核酸模板接触，其中第一引物包含特异性粘合(annealing)至靠近顺向股的第一接合器的第一序列，所述第二引物包含特异性粘合至靠近反向股的第一接合器的第二序列。(d)重复步骤(c)进行一个或多个PCR扩增循环，以得到目标核苷酸序列的PCR扩增子

本发明提出一种确定目标核苷酸序列的方法，其包括以下步骤。提供上述的扩增目标核苷酸序列的方法得到目标核苷酸序列的PCR扩增子。对目标核苷酸序列的PCR扩增子进行核酸测序，借此得到目标核苷酸序列的序列信息。

基于上述，本发明通过将发夹型的第二接合器与目标核苷酸序列的互补两股DNA(即顺向股及反向股)连接在一起并作为核酸模板，并使用位于第一接合器上的引物对核酸模板进行PCR扩增循环。因此，所得到的PCR扩增子的任一股皆具有顺向目标核苷酸序列以及反向目标核苷酸序列。此外，由于PCR扩增子的任一股皆包含顺向目标核苷酸序列以及反向目标核苷酸序列，因此在进行核酸测序分析时，自任一端进行测序皆可得到互补两股DNA区域的序列，且可将得到的互补两股DNA区域的序列互相比对，借此可提高原本目标核苷酸序列的准确度。此外，在本发明中是将互补两股DNA连接在一起进行测序及分析，因此可以降低测序的成本。

附图说明

图1为依照本发明的第一实施例的扩增目标核苷酸序列的方法的流程图。

图2为依照本发明的第二实施例的扩增目标核苷酸序列的方法的流程图。