[发明专利]一种脐带血间充质干细胞培养方法

权利要求书

1.一种脐带血间充质干细胞培养方法，其特征在于，包括以下操作步骤：

(1)脐带血的采集：将采集后的脐带血在24小时内放入脐带血保存液中进行保存，保存温度为3-5℃；

(2)脐带血的洗涤：取保存有脐带血的保存液，混合搅拌均匀后离心处理，然后向离心沉淀中加入清洗液，混合搅拌均匀后再次离心处理，得到上清和沉淀；

(3)脐带血富血小板血浆的制备与活化：将步骤(2)得到的上清继续离心后，去掉上部分的血清，中间及底部的沉淀为富血小板血浆，向得到的富血小板血浆中继续加入氯化钙溶液，激活处理后，进行离心，得到活化的富血小板血浆，所述激活处理的操作为36.8-37.2℃孵育处理25-35min或者3-5℃的冰箱中冷冻处理15-17h；

(4)脐带血单个核细胞的分离：将步骤(2)中得到的沉淀中加入杜氏磷酸盐缓冲液，混合均匀后，加入到淋巴细胞分离液中，吸取白膜层细胞即单个核细胞，将单个核细胞吸至另一洁净离心管中，加入杜氏磷酸盐缓冲液重复离心洗涤2-3次，收集底部单个核细胞沉淀，得到脐带血单个核细胞；

(5)预处理后的Transwell小室培养脐带血间充质干细胞：将步骤(4)中得到的脐带血单个核细胞以1×106/cm2的密度接种在预处理后的Transwell小室的下室面，进行培养脐带血间充质干细胞；

(6)脐带血间充质干细胞的纯化及扩增：细胞培养5-7天后更换完全培养基以弃除未贴壁细胞，后每3-4天半量换液一次，8-12天会发现零星的细胞集落，使用完全培养基扩增细胞得到纯化的脐带血间充质干细胞。

2.根据权利要求1所述的一种脐带血间充质干细胞培养方法，其特征在于，上述步骤(1)中，每100mL的保存液中含有1.8-2.2g的枸橼酸三钠、0.6-1.0g的枸橼酸、2.1-2.6g的葡萄糖、0.2-0.5g的腺嘌呤、2.8-3.4g的磷酸二氢钠，所述保存液在使用前经过灭菌处理。

3.根据权利要求1所述的一种脐带血间充质干细胞培养方法，其特征在于，上述步骤(2)中，清洗液为含有质量分数为0.5％的人血清白蛋白的生理盐水或者含有质量分数为0.5％的人血清白蛋白的杜氏磷酸盐缓冲液。

4.根据权利要求1所述的一种脐带血间充质干细胞培养方法，其特征在于，上述步骤(2)中，离心处理时，离心力大小为450-550g，离心时间为10min；上述步骤(3)中，第一次离心处理时，离心力大小为1100-1300g，离心时间为9-10min，第二次离心时，离心力大小为2500-3500g离心时间为15-25min。

5.根据权利要求1所述的一种脐带血间充质干细胞培养方法，其特征在于，上述步骤(3)中，氯化钙溶液中氯化钙的质量分数为3-5％。

6.根据权利要求1所述的一种脐带血间充质干细胞培养方法，其特征在于，上述步骤(3)中，预处理后的Transwell小室采用以下方法获得：提前24h按照1×103个/cm2的密度接种脐带间充质干细胞，包被六孔Transwell小室底部膜的上室面，使用的培养基为完全培养基。

7.根据权利要求6所述的一种脐带血间充质干细胞培养方法，其特征在于，所述完全培养基为基础培养基DMEM/F12，其中含有质量分数为4-6％的活化的富血小板血浆。

8.根据权利要求1所述的一种脐带血间充质干细胞培养方法，其特征在于，上述步骤(5)中，培养脐带血间充质干细胞的环境为37℃、饱和湿度、体积分数为5％的CO₂培养箱。