[发明专利]一种发酵法生产硫酸化多糖的菌株及其应用

说明书

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis GX10‑35，其保藏编号为CGMCC No.21277，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2020年12月2日；所述菌株通过从纳豆食品中筛选、分离、纯化、培养获得，能合成和分泌硫酸化多糖。本发明还公开了上述枯草芽孢杆菌GX10‑35通过发酵生产硫酸化多糖的方法。本发明不受化学法制备的硫酸化多糖易降解的缺点及动物软骨资源匮乏的约束，有利于大量生产；生产工艺简单，条件温和，因而成本较低；此外环境污染小。用本发明的菌株生产的硫酸化多糖可作为医药、营养食品、药用化妆品和功能性食物等的原料。

技术领域

本发明属于微生物发酵技术领域，涉及一种发酵法生产硫酸化多糖的菌株及其应用。

背景技术

硫酸多糖也称多糖硫酸酯或硫酸酯多糖，是一类富含有带负电荷硫酸根的化合物，包括从动、植物中提取的各种天然硫酸多糖(如肝素)，天然中性多糖的硫酸化修饰物及人工合成、半合成的各种硫酸多糖。近年来，硫酸多糖因具有抗氧化，抗感染、抗凝血、抗肿瘤、抗病毒、促进免疫等多方面功能和生物活性而受到人们的关注。硫酸化多糖，最先发现于软骨素以及从猪肠粘膜中提取的肝素，后来发现它还广泛存在于海藻类植物，如红藻、褐藻、绿藻。近年来，硫酸化多糖在医药、营养食品、药用化妆品和功能性食品等领域得到广泛应用，市场需求趋愈来愈大。而且，我国生产和出口量逐年大幅增长，硫酸化多糖发展前景广阔。

目前，我国主要采用化学法(浓硫酸法、氯磺酸-吡啶法、三氧化硫-吡啶法等)，将硫酸基团引入多糖，制备得到硫酸化多糖。其中浓硫酸法需要先加浓硫酸、正丁醇；氯磺酸-吡啶法需要在冷凝管和搅拌装置的烧瓶中盐水-冰浴下先加吡啶后加氯磺酸，待烧瓶中出现大量淡黄色固体，再加多糖粉末沸水浴反应；三氧化硫-吡啶法需要先加三氧化硫-吡啶进行热水浴,再加多糖粉末反应后，经NaOH溶液中和乙醇沉淀得到硫酸化多糖。极少有通过筛选得到微生物发酵生产硫酸化多糖的报道。而化学法修饰得制备硫酸化多糖存在反应速率低，多糖降解率高、具毒副作用等缺点，因此，急待开发新的生物资源及新的技术工艺来生产硫酸化多糖。

发明内容

为了解决现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种发酵法生产硫酸化多糖(GX10-35-P1)的菌株及其应用，通过发酵枯草芽孢杆菌制备硫酸化多糖的方法，解决现有技术化学法制备硫酸化多糖的降解和毒副作用问题。

本发明提供了一种硫酸化多糖生产菌株枯草芽孢杆菌，其分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis GX10-35)，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏时间为2020年12月2日，保藏编号为CGMCC No.21277。

本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis GX10-35)菌株菌落特征为乳白色、具褶皱、中间凸起、表面干燥且粗糙；显微镜观察菌体呈杆状，末端圆，单个或呈短链状排列。菌体中间有芽孢形成，革兰氏染色呈紫色，为革兰氏阳性杆状菌(见图1，图2)。本菌株是硫酸化多糖生产菌，其生理生化特征见下表1：

表1 生理生化试验结果

注：+表示阳性，-表示阴性；

通过测序分析得到芽孢杆菌(Bacillus subtilis GX10-35)的16S rDNA序列，全长为1453bp，使用BLAST对该菌株的16S rDNA基因和GenBank中己录入的细菌进行同源性比对，分析表明该菌与Bacillus subtilis strain JCM 1465序列同源性99.72％。结合16SrDNA全序列分析的系统发育研究结果(见图3)，将该菌株命名为Bacillus subtilis GX10-35。

本发明所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis GX10-35)的16S rDNA基因序列(1453bp)如SEQ ID NO：1所示。