[发明专利]一种柽柳内生拮抗真菌及其分离方法和应用

说明书

本发明公开了一种柽柳内生拮抗真菌及其分离方法和应用，属于农业生物防治技术领域。本发明公开的一种柽柳内生拮抗真菌HMST‑1，其保藏编号为CGMCCNo.19261。本发明提供了分离筛选获得柽柳内生拮抗真菌的方法，该菌株鉴定为链格孢菌，为有效防治棉花苗期根腐类病害提供了生防菌株；本发明提供了新疆柽柳内生链格孢菌的液体发酵液的生防功能及其代谢产物抑菌活性物质，为创制微生物农药新制剂提供了有效成分。

技术领域

本发明涉及微生物生防技术领域，更具体的说是涉及一种柽柳内生拮抗真菌及其分离方法和应用。

背景技术

目前，我国新疆棉花生产中主要依赖各种化学农药防治根腐类病害，存在病原菌抗药性增加、农药利用率低等缺点，极易造成环境污染、农药残留严重等问题，也对有益微生物的生存构成了威胁，并诱导侵染病菌抗性增强，导致其防效逐渐下降。因此，迫切需要寻找防治棉花红腐病的替代化学农药的施用技术及产品。

生物农药具有选择性强、残留低、高效低毒、不易产生抗药性等优点，其中，部分微生物农药来自于植物内生真菌，其内生真菌能够独立产生丰富的具有多种生物活性的次生代谢产物，是天然产物的重要来源，在农作物病害生物防控中具有重要的应用潜力。因此，植物内生真菌将是开发新型生物农药的重要微生物资源，其中利用植物内生真菌或其代谢产物对植物病菌的抑制作用就是一条重要的生防途径。

新疆柽柳(Tamarix chinensis)生境特殊，且具有很强的抗盐碱、抗旱、抗风沙、抗病虫害的能力，柽柳属植物的主要成分是多酚及其苷和鞣质类，其中多数化合物具有很好的生物活性，柽柳在开发利用方面，具有较高的药用价值和应用前景。

因此，提供一种柽柳内生拮抗真菌及其分离方法和应用是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种柽柳内生拮抗真菌及其分离方法和应用，对挖掘利用区域微生物生防资源、促进植物病理、农药等学科发展，以及农药减施增效具有重要的理论和实践意义。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种柽柳内生拮抗真菌HMST-1，其保藏编号为CGMCC No.19261，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2019年12月16日，分类命名为互隔交链孢霉Alternaria alternata。

进一步，一种柽柳内生拮抗真菌HMST-1的分离方法，具体步骤如下：

选择特殊生境下特殊株型、特殊形态柽柳；精选有效嫩枝组织，室内去油去杂浸泡；灭菌剪刀剪切分段、植体消毒、无菌水清洗、无菌滤纸过火焰、PDA培养基5点法分离培养；挑取菌落、单孢分离、对峙培养筛选、试管斜面保存。

进一步，一种柽柳内生拮抗真菌HMST-1液体发酵液的制备方法，具体步骤如下：

(1)将菌株HMST-1从试管斜面转接至PDA平板上活化，于25℃恒温培养5-7d后，挑取菌株HMST-1菌块于50mL的无菌水中，配制成浓度为1.0×10⁵个/mL的孢子悬浮液，备用；

(2)采用pH为7.0的PD液体培养基，以10％的接种比例在无菌条件下接入浓度为1.0×10⁵个/mL的孢子悬浮液，再加入3.0mmol/L的代谢因子KH₂PO₄，于25℃，150r/min条件下振荡培养5d；

(3)菌株HMST-1液体发酵液经高速冷冻离心机8000r/min离心10min后，取上清液稀释5-10倍。

进一步，所述柽柳内生拮抗真菌HMST-1在抑制棉花苗期红腐病菌和棉花立枯病菌中的应用。