[发明专利]一种致病疫霉LFD-RPA检测引物和探针及其应用

权利要求书

1.一种致病疫霉LFD-RPA检测引物和探针，其特征在于，引物和探针序列如下：

PiRPA-LFD-F：5’-TAACTGATACTAACCTCGTTCAACCTCGTA-3’，SEQ.ID.NO.1；

PiRPA-LFD-R：5’-CTCATTAATAAACTGATATCCGCAGGGTAAGG-3’，SEQ.ID.NO.2；

PiRPA-LFD-P：5’-GCTTCGATTCACGGACGACACGTTTGACGACACCTCCAGAGCACAA-3’SEQ.ID.NO.3；

所述PiRPA-LFD-R的5’端连接有Biotin；所述PiRPA-LFD-P的5’端连接有FAM荧光基团，第31位C和第32位A之间插入四氢呋喃分子，3’端连接有C3-spacer。

2.一种如权利要求1所述致病疫霉的LFD-RPA检测引物和探针的反应体系，其特征在于，具体如下：

反应体系为50μl：

3.如权利要求2所述的致病疫霉的LFD-RPA检测引物和探针的应体系，其特征在于，反应条件为：39℃温育5min，将反应管再次混匀，继续39℃温育25min。

4.一种利用权利要求1所述致病疫霉的LFD-RPA引物和探针快速鉴定致病疫霉的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取待检测样品基因组DNA；

(2)LFD-RPA检测反应体系：以步骤(1)提取的DNA为模板，利用引物PiRPA-LFD-F和PiRPA-LFD-R及探针PiRPA-LFD-P进行扩增；反应体系为50μl，包含29.5μl Rehydrationbuffer，10μM PiRPA-LFD-F和PiRPA-LFD-R各2.1μl，探针10μM PiRPA-LFD-P 0.6μl，待测模板DNA 2.0μl，无菌双蒸水11.2μl，将上述组分混匀后加入到50mg RPA冻干酶粉中，随后加入2.5μl280mM醋酸镁并颠倒混匀；在39℃温育5min，将反应管再次混匀，继续39℃温育25min；

(4)结果检测：采用侧流层析试纸条进行检测；取10μl步骤(3)的反应产物与100μlHybriDetect Assay Buffer混合，然后将试纸条样品段垂直插入混合液中，室温静置5min后观察结果；试纸出现两条紫红色条带，一条位于质控区内，一条位于检测区，则结果为阳性，表明样本中含有致病疫霉；当试纸条只有质控区出现一条紫红色条带，检测区没有条带，则结果是阴性，表明样本中不含有致病疫霉。

5.如权利要求1-4任一项所述的致病疫霉LFD-RPA检测引物和探针在制备致病疫霉菌分子检测试剂中的应用。

6.如权利要求1-4任一项所述的致病疫霉LFD-RPA检测引物和探针在制备致病疫霉菌RPA分子检测试剂中的应用。