[发明专利]一种GPHB5/GPHA2重组蛋白及其表达载体、制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种GPHB5/GPHA2重组蛋白及其表达载体、制备方法和应用，属于基因工程技术领域。表达所述GPHB5/GPHA2重组蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2所示。本发明将在真核表达系统中易于表达的GPHB5和GPHA2的基因片段进行人源密码子优化，使得GPHB5/GPHA2重组蛋白在Expi293F细胞中大规模表达。本发明所提供的GPHB5/GPHA2重组蛋白可作为多肽类减肥药应用。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种人源GPHB5/GPHA2重组蛋白及其表达载体、制备方法和应用。

背景技术

人促甲状腺激素(TSH)、促卵泡激素(FSH)、促肾上腺皮质激素(LH)和绒毛膜促性腺激素(CG)是糖蛋白激素家族的成员，该家族衍生自常见的α亚基与激素特异性β亚基的异源二聚化作用。2002年发现了两个新的人类糖蛋白激素样基因：α2(A2)和β5(B5)，基于两个新的糖蛋白激素亚基的二聚化，我们进行了一系列的研究。

发明内容

本发明提供一种GPHB5/GPHA2重组蛋白，表达该GPHB5/GPHA2重组蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2所示。将在真核表达系统中易于表达GPHB5和GPHA2的基因片段进行人源密码子优化，使得GPHB5/GPHA2重组蛋白在高产量蛋白表达系统(如；Expi293F细胞)中可大规模表达。

本发明还提供了一种含有表达GPHB5/GPHA2重组蛋白的基因的表达载体，在含有抗博莱霉素的抗性选择基因的表达载体中包含有SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2核苷酸序列，表达载体优选pBudCE4.1载体，载体序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明还提供了表达如上述重组载体的宿主菌。所述宿主菌为具有博莱霉素抗性的表达菌株，优选大肠杆菌E.coli MJ109。

本发明中表达GPHB5/GPHA2重组蛋白的载体的制备方法，合成表达GPHB5和GPHA2的全基因片段，并对pBudCE4.1载体进行如下处理：GPHB5基因克隆至限制性内切酶HindIII和BamH I酶切位点之间，GPHA2基因克隆至载体的Not I/Xho I位点之间，获得pBudCE4.1-GPHB5/GPHA2重组质粒。本发明中表达GPHB5和GPHA2的全基因片段由南京金斯瑞公司合成。

将pBudCE4.1-GPHB5/GPHA2质粒转化至MJ109大肠杆菌中，挑取单克隆进行质粒酶切鉴定以及DNA测序方法验证插入序列的正确性。将测序正确的重组质粒pBudCE4.1-GPHB5/GPHA2为模板加入到哺乳动物Expi293F细胞中，即可诱导表达GPHB5/GPHA2重组蛋白。

因此，本发明的GPHB5/GPHA2重组蛋白的制备方法，包括如下步骤：

步骤1，利用HindIII/BamHI双酶切位点将SEQ ID NO:1所示序列插入至表达载体pBudCE4.1中，获得C端含有His标签的重组质粒；利用NotI/Xho I双酶切位点将SEQ ID NO:2所示序列插入至表达载体pBudCE4.1中，获得C端含有His标签的重组质粒；

步骤2，将pBudCE4.1-GPHB5/GPHA2重组质粒为模板转染至HEK293T细胞或Expi293F细胞中进行表达，诱导表达GPHB5/GPHA2重组蛋白。

在上述步骤1之后，还包括将pBudCE4.1-GPHB5/GPHA2重组质粒转化至MJ109大肠杆菌中，挑取单克隆进行质粒酶切鉴定以及DNA测序方法验证插入序列的正确性。