[发明专利]一种稳定高产海藻酸裂解酶的大肠杆菌突变菌株

说明书

本发明涉及基因工程和微生物改造技术领域，具体涉及一种稳定、高产海藻酸裂解酶的大肠杆菌突变菌株。申请人首先构建得到重组表达海藻酸裂解酶Alg的大肠杆菌工程菌株，然后通过紫外诱变筛选，获得了一株稳定性好、海藻酸裂解酶产量高的突变株，保藏编号为CCTCC NO:M2020792，为海藻酸裂解酶的工业化生产奠定了基础。

技术领域

本发明属于微生物诱变筛选技术领域，具体涉及一种稳定高产海藻酸裂解酶的大肠杆菌突变菌株。

技术背景

海藻酸主要是从马尾藻、海带、泡叶藻、巨藻等褐藻中提取的多糖聚合物，故又称褐藻胶，是褐藻细胞壁的主要成分之一，也是褐藻中含量最多的多糖，占褐藻总干重的左右。由β-D-甘露糖醛酸(M)和α-L-古罗糖醛酸(G)经过1，4-键合形成的线型共聚物。因其具有凝胶性和生物相容性, 在医学、制药和食品领域有广泛的应用. 由于海藻酸特殊的理化性质和结构, 使之不能够直接被生物体利用, 而其降解后释放的寡糖却可以被广泛的利用. 而近年来的研究证明低分子量海藻酸寡糖还具有多种生物活性, 如抗肿瘤、抗菌、增强巨噬细胞吞噬作用、促进白细胞因子的产生、促植物生长等, 在药物研制、功能食品开发、农业等领域具有广阔的开发前景。综上所述, 对海藻酸的降解是利用海藻酸多糖的前提条件。

目前降解海藻酸的方法一般有三种：化学法、物理法和生物降解法。其中生物降解法即海藻酸裂解酶酶解法，该法降解海藻酸条件温和、过程可控、得率高、绿色安全、环境友好，是海藻酸生物法降解的主要研究方向之一。

海藻酸裂解酶（alginate lyase，Alg）催化海藻酸的β-1，4-糖苷键,通过β-消去反应的解聚作用，在C-4和C-5之间形成双键, 在生成寡糖的非还原性末端产生 4-deoxy-L-erythro-hex-4-ene pyranosyluronate, 并且在 230～240 nm 有强吸收。Alg的来源广泛，主要有三大类，第一类是微生物，如海洋细菌、土壤细菌、真菌等；第二类是海洋软体动物和棘皮动物，如海螺、海参、鲍鱼等；第三类是植物，如巨藻、泡叶藻、海带等。目前，海藻酸裂解酶的生产大多是依靠海藻酸分解菌。虽然野生型海藻酸分解菌能有效的获得定量的酶蛋白，但产量很低、提取和纯化步骤繁琐，成本较高，很难满足实际应用要求。因此想要获得高效大量的酶对其进行基因工程方面的研究是重要的方法，其中异源表达是解决其在天然生物体中含量低，生产成本昂贵，难纯化,获得高产量、活性酶的有效方法。目前开发海藻酸裂解酶高产菌株仍是本领域的研究热点，对于降低海藻酸裂解酶的生产成本具有重要的意义。

发明内容

本发明为解决现有技术问题，提供了一种稳定、高产海藻酸裂解酶的大肠杆菌突变菌株。申请人首先构建得到重组表达海藻酸裂解酶Alg的大肠杆菌工程菌株，然后通过紫外诱变筛选，获得了一株稳定性好、海藻酸裂解酶产量高的突变株，为海藻酸裂解酶的工业化生产奠定了基础，从而弥补现有技术的不足。

本发明一方面提供了一种重组质粒，其携带有海藻酸裂解酶基因。

所述的海藻酸裂解酶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO: 1，其编码氨基酸序列为SEQ ID NO:2。

本发明一方面提供了一种大肠杆菌工程菌，其携带有上述重组质粒。

本发明还提供了一种大肠杆菌突变菌，是以上述大肠杆菌工程菌为出发菌，通过紫外诱变方法获得的。

所述突变菌命名为大肠杆菌EcalgH（ Escherichia coli EcalgH），已于2020年11月30日保藏于中国武汉 武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2020792。

本发明还提供了上述突变菌在海藻酸裂解酶生产中的应用。