[发明专利]一种叶绿体-细胞膜双定位基因及其编码的蛋白和应用

说明书

本发明属于植物分子生物学领域，涉及编码蛋白在叶绿体‑细胞膜双定位的基因，特别是一种叶绿体‑细胞膜双定位基因及其编码的蛋白和应用。所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。所述基因编码蛋白NtODB的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明中NtODB蛋白和荧光报告蛋白融合可作为植物细胞叶绿体和细胞膜的双定位标记，NtODB基因可作为一个植物叶绿体‑细胞膜双表达的标记基因。将NtODB基因与荧光报告基因融合表达作为叶绿体和细胞膜的标记，在目的基因的亚细胞定位研究时可以提供准确对照，有力地弥补根据氨基酸序列预测蛋白亚细胞定位的不足。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及烟草叶绿体定位、细胞膜定位标记基因，特别是一种叶绿体-细胞膜双定位基因及其编码的蛋白和应用。

背景技术

细胞是生物体进行生命活动的基本功能单位。在植物真核细胞中，包括线粒体、叶绿体、过氧化物酶体、溶酶体、内质网、细胞核、高尔基体、液泡、囊泡等亚细胞结构。研究蛋白质在细胞中的亚细胞定位对于分析蛋白质功能十分重要。

亚细胞定位是指某种蛋白或某一基因表达产物在细胞内的具体存在部位，如细胞核，细胞膜或某一特定细胞器上存在。

实验定位法和生物信息学预测法是亚细胞定位常用的两种手段。生物信息学预测方法具有利用大数据提供预先参考信息的优势，因而对传统的实验方法发挥良好的辅助作用，也节省了时间成本。但难以做到精准预测，尤其是对于定位于多个细胞器的蛋白质而言。常用的植物蛋白亚细胞定位的实验方法，包括融合报告基因定位法、免疫组织化学定位法、共分离标记酶辅助定位法、蛋白质组学定位技术。而融合报告基因定位法是其中最常用的方法。其原理是将目的蛋白基因与易于检测的报告基因进行融合，构建融合基因表达载体, 表达融合蛋白, 然后借助于报告基因表达产物的特征来定位目的蛋白质。通常是将目的蛋白与报告基因（如绿色荧光蛋白基因GFP）融合表达，在激光共聚焦显微镜下观察荧光的表达部位从而致使目的蛋白在细胞内的定位。利用GFP融合蛋白技术来进行活细胞定位研究是目前较为通用的一种方法，且GFP蛋白的分子量为27kD，经激光扫描共聚集显微镜激光照射后，可产生一种绿色荧光，从而对蛋白质进行精确定位。绿色荧光蛋白(GFP)基因及其荧光突变体(黄色荧光蛋白(YFP)基因、蓝色荧光蛋白(BFP)基因、青色荧光蛋白(CFP))和红色荧光蛋白(RFP)基因及其突变体(mCherry，mStrawberry，mTangerine，mBanana，mOrange)等也是常用的亚细胞定位报告基因。虽说融合报告基因定位法通过实验的耗时长、成本高，仪器设备昂贵，而且实验结果需要人为的经验判断，具有一定的主观性。但该定位方法的结果相对精准，可以有效弥补生物信息学预测方法的不足，具有预测法无可比拟的优势。具有易操作，适用性强，周期较短等优点，可以应用于活体的实时定位和动态研究，灵敏度高。但融合报告基因定位法定位结果可能与在体内条件下的蛋白质的分布有差异；融合蛋白的过强或者过弱表达都可能会使定位结果不清, 尤其对质膜等膜类蛋白的定位可能产生较大影响。而开发细胞器荧光标记作为对照可以弥补融合报告基因定位方法的不足。

发明内容

本发明发现了用于定位烟草叶绿体、定位烟草细胞膜的基因，提出一种叶绿体-细胞膜双定位基因及其编码的蛋白和应用，为烟草叶绿体和细胞膜定位标记提供了新选择，并首次发现了烟草ODB1蛋白具有定位细胞膜的功能。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种定位蛋白NtODB，所述NtODB蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

一种编码NtODB蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

上述的基因在叶绿体和细胞膜中双定位表达外源蛋白的应用。

含有上述基因的表达载体，所述表达载体为亚细胞定位载体。