[发明专利]一种基于YH66_08550基因的产L-异亮氨酸的重组菌株及其构建方法与应用

说明书

本发明公开了一种基于YH66_08550基因的产L‑异亮氨酸的重组菌株及其构建方法与应用。本发明通过对YH66_08550基因的敲除，发现该基因编码的产物对L‑异亮氨酸生产能力产生影响，通过在编码序列引入点突变，或者增加该基因的拷贝数或过表达获得重组菌株，所述点突变是使YH66_08550基因序列第607位碱基由鸟嘌呤(G)突变为腺嘧啶(A)，使编码的相应氨基酸序列第203位谷氨酸变为赖氨酸。所获得的菌株与未改造的菌株相比，有利于生产高浓度的L‑异亮氨酸。

技术领域

本发明属于基因工程和微生物技术领域，具体涉及一种基于YH66_08550基因的产L-异亮氨酸的重组菌株及其构建方法与应用。

背景技术

FISCHER于1901年第一次从蛋白质的水解液中发现了和L-亮氨酸旋光度不同的物质，L-异亮氨酸这种物质由此问世。L-异亮氨酸作为人和动物体内所必需的分支氨基酸之一，在食品、牲畜饲料和医药等领域具有广泛的市场及应用前景。如功能性饮料中添加L-异亮氨酸，能有效的防止肌肉损伤，提高运动员的耐力；毛湘冰等在仔猪饲料中添加适量L-异亮氨酸能改善其回肠屏障功能，能有效预防轮状病毒引起的腹泻疾病；L-异亮氨酸还能在葡萄糖协同作用下促进人体内胰岛素的分泌，达到迅速降低血液中的血糖浓度的目的，因而能有效的预防肥胖人群易得的突发性高血糖病症。

L-异亮氨酸在1904年第一次被EHRLICH从甜菜糖浆中分离出来。随着对制造L-异亮氨酸的不断深入研究，人们开始在工业上大规模的生产L-异亮氨酸。相比利用蛋白质水解法和化学合成法生产L-异亮氨酸，微生物发酵法在生产过程中绿色环保、成本大大减少、反应易控制以及能适用于大规模的生产，是现在工业上生产L-异亮氨酸的主要方法。微生物发酵法包括添加前体物发酵法和直接发酵法。添加前体物发酵法因前体物作为中间代谢产物能够直接参与L-异亮氨酸的合成，故而L-异亮氨酸生物合成路径中的关键酶受到的反馈调节作用较小，能较快的生成终产物，但前体物价格昂贵，并不适用于大规模的工业发酵。相对于添加前体物发酵法，利用直接发酵法生产L-异亮氨酸的成本要少的多，得以被大多数企业采纳用来生产L-异亮氨酸。

生产L-异亮氨酸的菌株主要是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)和大肠杆菌(Escherichia coli)。谷氨酸棒杆菌具有无内毒素、代谢同工酶少，有利于解除反馈抑制或转录衰减以及关键代谢酶抗反馈抑制能力强等特点，因此大多数研究者倾向于研究谷氨酸棒杆菌及其亚种，如黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)和乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)等。优良菌种的选育依然是高产L-异亮氨酸的关键，随着高通量筛选技术的发展，结合传统诱变技术，有助于找到未知性状的高产L-异亮氨酸突变株。

虽然已筛选到一些可以提高L-异亮氨酸产量的菌株，但是为了满足日益增加的需求，仍需要找到更多高产L-异亮氨酸的突变株。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种多核苷酸及含有该多核苷酸的重组菌株,以及将重组菌株用于改善细菌的L-异亮氨酸生产能力。为了实现上述目的，本发明的发明人研究发现，具有L-异亮氨酸生产能力的谷氨酸棒杆菌ATCC15168基因组(GenBank：CP011309.1)中YH66_08550基因(GenBank：AKF27595.1)，可以通过修饰该基因或改善其表达，获得L-异亮氨酸产量提高的重组菌株，与未改造的野生型菌株相比，重组菌株的产L-异亮氨酸能力更强。

本发明采用如下技术方案实现：

本发明的第一方面，提供了生成L-异亮氨酸的细菌，其具有编码如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的多核苷酸的改善的表达。根据本发明，所述改善的表达是所述多核苷酸表达增强，或者编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸具有点突变，或者编码SEQ IDNO:3的氨基酸序列的多核苷酸具有点突变且表达是增强的。

所述SEQ ID NO:3的氨基酸序列是基因YH66_08550编码的蛋白。