[发明专利]一种以酸枣愈伤组织为受体的遗传转化方法

权利要求书

1.一种以酸枣愈伤组织为受体的遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)遗传转化受体的获取

播种酸枣无菌种子，待无菌苗长出真叶，选取酸枣茎段、叶片、子叶和胚轴，分别切成0.5～1cm×0.5～1cm大小的外植体，置于半固体MS愈伤诱导培养基，诱导酸枣愈伤，作为遗传转化材料；

(2)农杆菌培养与浸染液制备

将携带有植物表达载体pCAMBIA2300-GFP农杆菌菌液GV3101接种于液体LB培养基，于恒温摇床以28℃、200～250rpm的条件暗培养菌液，直至OD₆₀₀为0.6～0.8；

将所述OD₆₀₀为0.6～0.8的农杆菌菌液用液体MS重悬，得到浸染液，此前已经于超净台向液体MS中加入200μmol/L的乙酰丁香酮；

(3)愈伤浸染：

将步骤(2)所得的浸染液与酸枣愈伤组织于恒温摇床以28℃、100～150rpm的条件黑暗共培养30～35min，得到浸染后的外植体；

(4)共培养：

将步骤(3)所得浸染后的酸枣愈伤沥干后置于半固体MS共培养基，黑暗条件下共培养2～3天；

(5)除菌：

用含有250mg/L头孢噻肟钠的无菌水清洗步骤(4)所得的酸枣愈伤7～8min，重复3～4次；

(6)抑菌培养：

将步骤(5)得到的酸枣愈伤置于半固体MS抑菌培养基，抑菌培养30～45天；

(7)筛选培养：

将步骤(6)所得的抑菌培养后的酸枣愈伤置于半固体MS筛选培养基，经3～5代、每代3～4周的筛选培养后，得到纯合的转基因酸枣愈伤；

(8)抗性愈伤的鉴定：

利用RT-PCR方法对遗传转化后的酸枣愈伤进行检测，根据是否有报告基因的条带，确定目的基因的整合状况；

所述半固体MS愈伤诱导培养基包括0.5～2mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸，0.4mg/L噻苯隆，20～30g/L蔗糖，6～7g/L琼脂，pH5.8～6.0的半固体MS培养基；

所述农杆菌菌液GV3101的接种量为0.25～0.5％；所述液体LB含50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平；

所述步骤(2)中，农杆菌为GV3101，其携带的质粒载体为pCAMBIA2300-GFP绿色荧光表达载体；

所述半固体MS共培养基包括0.5～2mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸，0.4mg/L噻苯隆，20～30g/L蔗糖，6～7g/L琼脂，pH5.8～6.0的半固体MS培养基；

所述半固体MS抑菌培养基包括0.5～2mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸，0.4mg/L噻苯隆，250mg/L头孢霉素，250mg/L特美汀，20～30g/L蔗糖，6～7g/L琼脂，pH5.8～6.0的半固体MS培养基；

所述半固体MS筛选培养基包括0.5～2mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸，0.4mg/L噻苯隆，20mg/L卡那霉素，250mg/L头孢霉素，250mg/L特美汀，20～30g/L蔗糖，6～7g/L琼脂，pH5.8～6.0的半固体MS培养基；

所述步骤(1)、(4)、(6)、(7)的培养条件为温度23～25℃，光周期12～14h/d，光照强度2500～2800lx。