[发明专利]基于美洲大蠊雄性附腺生殖相关基因SP28设计的siRNA及其制备方法与应用

说明书

本发明公开了基于美洲大蠊雄性附腺生殖相关基因SP28设计的siRNA及其制备方法与应用，所述siRNA为由SEQ ID No.2所示的核苷酸序列及与SEQ ID No.2所示的核苷酸序列反向互补的核苷酸序列组成的双链RNA经切割而成，将该siRNA导入美洲大蠊体内，能够显著抑制SP28基因的表达，进而影响雌虫孵化率和孵化个体数，进而导致蟑螂后代数量显著的减少，从而实现防治害虫的最终目的，为害虫防治提供了新的分子靶标。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及基于美洲大蠊雄性附腺生殖相关基因SP28设计的 siRNA及其制备方法与应用。

背景技术

美洲大蠊(蟑螂)是地球上最古老的昆虫之一，在全球范围内广泛分布，是世界公认卫生害虫。蟑螂偏爱阴暗潮湿的环境，例如厨房、厕所、仓库、下水道、地下室等处群居。蟑螂作为一种杂食性的昆虫，食物种类非常广泛，包括米饭、面包、水果、甜食、熟食等等，不仅会污染食物，还会传播疾病，是多种细菌、病毒和寄生虫的携带者，给人类的生活和安全带来了极大的危害。除此之外，蟑螂具有极强的繁殖力，一只成熟的雌蟑螂一身中可以多次产卵，每颗卵可以孵化出约16只幼虫。由于蟑螂的这些特质，导致它成为一种最为难以防治的卫生害虫之一。

随着全世界对卫生害虫的重视，市面上出现的多种多样的蟑螂药。这些蟑螂药对防治蟑螂具有一定效果，但是并不能完全的控制蟑螂，一段时间内蟑螂又再次爆发，而且这些药物往往具有一定的毒性，对生态环境具有一定的影响。随着长期大量的使用蟑螂出现了耐药性，意味着那些杀蟑螂药，很难再对蟑螂起到控制作用。卫生害虫与人们生活质量和食品一系列问题的矛盾日益凸显。开发环境友好、高效、低毒的蟑螂防治方法是对于国家经济发展、社会进步和食品安全具有重要意义。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种基于美洲大蠊雄性附腺生殖相关基因SP28设计的siRNA，能够特异沉默基因SP28导致雌虫的生殖力和孵化率显著降低。

本发明还提出上述siRNA的制备方法。

本发明还提出提供编码上述siRNA的基因及含有该编码基因的表达载体、转基因细胞系或宿主菌。

本发明还提出上述siRNA的应用。

根据本发明的第一方面实施方式的基于美洲大蠊雄性附腺生殖相关的SP28基因设计的 siRNA，所述siRNA为由SEQ ID No.2所示的核苷酸序列及与SEQ ID No.2所示的核苷酸序列反向互补的核苷酸序列组成的双链RNA经切割而成。

根据本发明的一些实施方式，所述切割采用内切酶。

根据本发明的第二方面实施方式的上述siRNA的制备方法，包括以下步骤：

S1、根据美洲大蠊SP28基因序列设计dsRNA靶向序列；

S2、根据dsRNA靶向序列设计引物，通过PCR扩增克隆至质粒载体中；

S3、基于重组质粒载体设计两端含有T7启动子的引物，进行PCR扩增；

S4、将步骤S3得到的PCR产物转录合成得到dsRNA；

S5、将合成的dsRNA切割成siRNA。

根据本发明的一些实施方式，步骤S2所述载体选自p18T载体。

根据本发明的一些实施方式，步骤S4所述转录合成采用T7RiboMAX Express RNAiSystem。

根据本发明的一些实施方式，步骤S5所述的切割dsRNA采用试剂盒RNaseIII。

根据本发明的一些实施方式，步骤S5所述切割而成的siRNA的分子量约为21nt。