[发明专利]一种利用ALA6鉴定紫花苜蓿耐热性的方法

权利要求书

1.一种利用ALA6鉴定紫花苜蓿耐热性的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、材料选择处理

选择紫花苜蓿；将种子播于花盆中，基质为灭菌泥炭土，放置于光照培养箱内，浇霍格兰营养液；

步骤二、高温胁迫方法

将一定苗龄的紫花苜蓿进行不同空气高温和时间胁迫后，分别测定根、茎和叶12个P₄型ATP酶基因：ALA1～ALA12的相对表达量；

步骤三、相对电导率测定

参照叶尚红的方法并稍加改良，分别称取根、茎和叶0.20g放入3支试管中，在试管中加入15mL蒸馏水，室温下放置30min，用电导率仪器测定电导率S1，然后试管置沸水浴中20min，冷却后电导率仪测定电导率S2和蒸馏水电导率S0，并计算相对电导率；

相对电导率(％)＝(S1－S0)/(S2－S0)×100％

步骤四、MDA含量测定

分别称取根、茎和叶0.20g放入研钵中，加入少量石英砂和2mL蒸馏水研磨至匀浆，转移至20mL刻度试管中，用3mL蒸馏水分两次冲洗研钵倒入提取液；然后另取一支刻度试管，加入5mL蒸馏水作为空白对照；分别在提取液和空白对照中各加入0.50％硫代巴比妥酸溶液5mL，在沸水浴上加热15min，待取出试管冷却后记下液体体积；再把液体转入离心管中，离心机3000rpm离心10min，取上清液到1cm的比色皿中，测定在600nm、532nm和450nm波长下的光吸收值，并计算MDA含量；

步骤六、根、茎和叶总RNA的提取和反转录

按照Super总RNA提取试剂盒的方法，分别提取不同胁迫温度和时间处理后根、茎和叶的总RNA，并跑1％琼脂糖凝胶电泳(0.27g琼脂糖和27ml 1×TAE)，观察其RNA质量；两条RNA带明显，无弥散，说明RNA未发生明显降解，可进行下一步总RNA反转录，用RTMaster Mix Kit试剂盒反转录合成cDNA；

步骤七、P₄型ATP酶基因荧光引物设计和相对表达量测定

以紫花苜蓿肌动蛋白(Actin)为内参，根据NBCI中已登录的P₄型ATP酶基因序列为参考[8]，用Primer designing tool在线软件(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi？LINK_LOC＝BlastHome)设计引物(表1)，在TSINGKE生物公司合成；用qPCR Master Mix(2X)试剂盒测定紫花苜蓿根、茎和叶中P₄型ATP酶基因相对表达量；所用的仪器为QuantStudio 5.0，反应体系为qPCR Master Mix,2x 10uL,10uM Primer F 0.4uL,10uM Primer R 0.4uL,CXR 100x^★0.2uL,Template DNA2 uL,ddH₂O7uL；反应程序为Hold Stage 50℃2min，95℃10min；PCR Stage 95℃5s，60℃15s，72℃34s；Melt Curve Stage 95℃15s，60℃1min，95℃15s；P₄型ATP酶基因相对表达量的计算采用2^—△△Ct法；

表1 试验选用的基因引物

步骤八、数据处理与分析

用Excel、SPSS 17.0、DPS 2006软件进行数据分析；计算隶属函数值。

2.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述步骤一中，具体为：供试材料为‘德钦’紫花苜蓿；将种子播于花盆中(基质为灭菌泥炭土)，放置于光照培养箱内，温度为23℃/20℃(白/夜)，光周期为16h/8h(白/夜)，相对湿度为65％，光强为400μmol·m^-2·s^-1，每隔2d浇霍格兰营养液200mL。