[发明专利]灵芝丙酮酸转运蛋白基因在调控灵芝纤维素酶活性中的应用

权利要求书

1.一种灵芝丙酮酸转运蛋白基因，其特征在于，该基因为如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示的灵芝丙酮酸转运蛋白基因中的至少一种。

2.由权利要求1所述的灵芝丙酮酸转运蛋白基因编码的丙酮酸转运蛋白，其特征在于，如SEQ ID NO.1所示的灵芝丙酮酸转运蛋白基因编码的丙酮酸转运蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，如SEQ ID NO.2所示的灵芝丙酮酸转运蛋白基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

3.一种灵芝丙酮酸转运蛋白基因沉默载体，其特征在于：该载体采用以下步骤构建：设计正、反向上游引物，以灵芝总cDNA为模板进行PCR扩增获得如权利要求1所述的灵芝丙酮酸转运蛋白基因的靶向干扰片段，并将所获得的靶向干扰片段插入到沉默载体pAN7-dual的KpnI和SpeI酶切位点之间得到灵芝丙酮酸转运蛋白基因沉默载体；用于扩增如SEQ IDNO.1所示的灵芝丙酮酸转运蛋白基因的靶向干扰片段的正、反向上游引物如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示，用于扩增如SEQ ID NO.2所示的灵芝丙酮酸转运蛋白基因的靶向干扰片段的正、反向上游引物如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。

4.权利要求1所述的灵芝丙酮酸转运蛋白基因在调节灵芝纤维素内切酶活性中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：通过沉默灵芝菌丝体中如权利要求1所述的灵芝丙酮酸转运蛋白基因提高灵芝纤维素内切酶活性。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：通过沉默灵芝菌丝体中如SEQ ID NO.1或/和SEQ ID NO.2所示的两种灵芝丙酮酸转运蛋白基因提高灵芝纤维素内切酶活性。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述沉默灵芝菌丝体中如权利要求1所述的丙酮酸转运蛋白基因的过程为：分别构建权利要求1中如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的两种丙酮酸转运蛋白基因的沉默载体并分别转化灵芝原生质体，通过抗性筛选获得丙酮酸转运蛋白基因沉默的阳性转化子以沉默灵芝菌丝体中的丙酮酸转运蛋白基因。

8.权利要求2所述的灵芝丙酮酸转运蛋白在调节灵芝纤维素内切酶活性中的应用。

9.权利要求3所述的灵芝丙酮酸转运蛋白基因沉默载体在调节灵芝纤维素内切酶活性中的应用。

10.一种提高灵芝纤维素内切酶活性的方法，其特征在于：通过沉默灵芝菌丝体中如权利要求1所述的丙酮酸转运蛋白基因来提高灵芝纤维素内切酶活性。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：通过沉默灵芝菌丝体中如SEQ ID NO.1或/和SEQ ID NO.2所示的两种灵芝丙酮酸转运蛋白基因提高灵芝纤维素内切酶活性。

12.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：所述沉默灵芝菌丝体中如权利要求1所述的丙酮酸转运蛋白基因的过程为：设计正、反向上游引物，以灵芝总cDNA为模板进行PCR扩增分别获得如SEQ ID NO.1所示的丙酮酸转运蛋白基因的靶向干扰片段和如SEQ IDNO.2所示的丙酮酸转运蛋白基因的靶向干扰片段，并将所获得的靶向干扰片段分别插入到沉默载体pAN7-dual的KpnI和SpeI酶切位点之间得到如SEQ ID NO.1所示丙酮酸转运蛋白基因的沉默载体和如SEQ ID NO.1所示丙酮酸转运蛋白基因的沉默载体并分别转化灵芝原生质体，通过抗性筛选获得阳性转化子以沉默灵芝菌丝体中的丙酮酸转运蛋白基因；用于扩增如SEQ ID NO.1所示的灵芝丙酮酸转运蛋白基因的靶向干扰片段的正、反向上游引物如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示，用于扩增如SEQ ID NO.2所示的灵芝丙酮酸转运蛋白基因的靶向干扰片段的正、反向上游引物如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。