[发明专利]一种番茄斑萎属病毒的蛋白标准物质及其应用

权利要求书

1.一种番茄斑萎属病毒的蛋白标准物质，其特征在于，通过真核表达载体pcDNA3.1转入哺乳动物细胞293表达株中，经培养发酵获得表达产物分子，将获得的表达产物颗粒进行DNase I消化，离心弃沉淀，沉淀即是含有外壳蛋白和复制酶基因的表达产物，再经过His标签的亲和纯化、分子筛纯化，获得含有所需组分的纯化组分，将最终纯化产物进行稀释，对融合蛋白产物进行OD值测定，依据OD值换算稀释产物，获得病毒外壳蛋白和复制酶基因融合表达的标准蛋白物质，所述pcDNA3.1-RP载体为包含番茄斑萎属病毒的外壳蛋白和复制酶融合蛋白的表达载体。

2.根据权利要求1所述的蛋白标准物质，其特征在于，获取包含番茄斑萎属病毒的外壳蛋白和复制酶融合蛋白的表达载体，具体过程如下:

1)根据复制酶基因序列，设计一对特异性引物，所述一对特异性引物为：

RdRp-F:5’-ATGAACATCCAGAAAATACAAA-3’

RdRp-R:5’-GACTTCAGATTTGATCTTTTGAG-3’；

预期扩增产物为TSWV的复制酶蛋白N端约100氨基酸，即复制酶基因，并引入酶切位点BstXI；分别双酶切复制酶基因；

2)根据外壳蛋白基因序列，设计一对特异性引物，所述一对特异性引物为：

CP-F:5’-ATGTCTAAGGTTAAGCTCACTAAGGA-3’

CP-R：5’-ACAGACAAAACTTGCAGAACTTGCT-3’；

预期扩增产物为TSWV的外壳蛋白，即CP基因，并引入酶切位点:EcoRV，通过融合引物进行重叠PCR扩增，获得复制酶基因与外壳蛋白基因融合的DNA片段，并进行BstXI/EcoRV双酶切后回收纯化，

BstXI/EcoRV双酶切pcDNA3.1载体，并将CP基因和复制酶基因融合后连接到PET32a载体上，最终得到pcDNA3.1-RP载体；所述融合基因序列如序列表中SEQ ID N0.3所示。

3.根据权利要求2所述的蛋白标准物质，其特征在于，用于病毒检测的外壳蛋白基因序列片段，如序列表中SEQ ID N0.1所示，所述基因为TSWV外壳蛋白基因中的一个片段。

4.根据权利要求2所述的蛋白标准物质，其特征在于，用于病毒检测的复制酶基因序列片段，如序列表中SEQ ID N0.2所示，所述基因为TSWV复制酶基因中的一个片段。

5.根据权利要求1所述的蛋白标准物质，其特征在于，表达产物分子进行DNase I消化，然后离心弃沉淀，保留上清；加入终浓度50％饱和硫酸铵，沉淀表达产物，离心弃上清，获得沉淀即是含有外壳蛋白和复制酶基因的表达产物，最后用PBS溶液重悬，获得含有所需粗体组分，将获得含有表达产物分子的溶液进行His标签的亲和纯化，经Ni-NTA凝胶介质结合目的蛋白后，用100mM咪唑洗脱所需组分，获得含有所需组分的纯化组分。

6.根据权利要求1所述的蛋白标准物质，其特征在于，所述分子筛纯化为经葡聚糖凝胶介质筛选目的蛋白后，用保存缓冲液换液所需组分，获得含有所需组分的纯化组分，保存缓冲液为20mM Tris、0.1M NaCl、ρΗ8.0。