[发明专利]灵芝免疫调节蛋白突变体及应用

说明书

一种灵芝免疫调节蛋白突变体，包括：FIP‑gluM_N31S、FIP‑gluM_T36N和FIP‑gluM_N31S/T36N，其中：FIP‑gluM_N31S的氨基酸序列及核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4所示；FIP‑gluM_T36N的氨基酸序列及核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5所示；FIP‑gluM_N31S/T36N的氨基酸序列及核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示。本发明能够解决FIP‑glu在应用对细胞毒性较大的问题，经过改造的突变体对细胞产生的毒性相较于灵芝免疫调节蛋白(FIP‑glu)有显著性降低，可以有效提高其利用价值。

本申请为：申请号[201910792979.3]申请日[2019/8/27]名称[灵芝免疫调节蛋白突变体及应用]之分案申请。

技术领域

本发明涉及的是一种生物工程领域的技术，具体是一种灵芝免疫调节蛋白突变体。

背景技术

真菌免疫调节蛋白(fugal immunomodulatory protein，FIP)最初分离于高等担子菌，是一种具有免疫调节功能的小分子蛋白质。1989年Kino等人从灵芝(Ganodermaspp.)中分离出第一种FIP(LZ-8或FIP-glu)后，研究人员陆续从多种食药用菌中发现了更多的FIP。它们构成了一个新的蛋白质家族——FIP。FIP家族的蛋白质具有抗肿瘤、抗过敏、刺激免疫细胞产生多种细胞因子等多种免疫调节作用，具有良好的临床应用前景和药用保健价值。真菌免疫调节蛋白由110～140个氨基酸组成，分子量约为13kD，其中缺乏组氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸，富含天冬氨酸和缬氨酸。其N末端的氨基酸均为乙酰化氨基酸。绝大多数的FIP是以同型二聚体的形式存在的。此外，FIP与免疫球蛋白重链可变区具有很大的相似性。

研究发现，FIP对多种癌细胞均表现出明显的生长抑制活性。例如，在大肠杆菌中表达的重组FIP-gts可在内体和体外抑制人肺癌细胞A549的生长(Chien-Huang Liao，Yi-Min Hsiao， Chung-Ping Hsu，Meei-Yn Lin，James Chun-Huan Wang，Yu-Lu Huang，etal.(2006). Transcriptionally mediated inhibition of telomerase of fungalimmunomodulatory protein from ganoderma tsugae in a549 human lungadenocarcinoma cell line.Molecular Carcinogenesis，45.)，是通过下调端粒酶催化亚基(hTERT)的转录调节，抑制端粒酶活性来造成对细胞的抑制生长。此外，从酵母中获得的重组FIP-glu明显抑制人白血病细胞NB4(Lin，J.W.，Hao，L.X.， Xu，G.X.，Sun，F.，Gao，F.，Zhang，R.，et al.(2009).Molecular cloning and recombinant expression of a geneencoding a fungal immunomodulatory protein fromganoderma luciduminpichiapastoris.WorldJournal of MicrobiologyBiotechnology，25(3)， 383-390.)、人肺癌细胞A549和Lewis肺癌细胞LLC1(Wu，C.T.，Lin，T.Y.，Hsu，H.Y.，Sheu，F.，Ho，C.M.，Chen，I.T..(2011).Lingzhi-8mediates p53-dependent growth arrest of lung cancercells proliferation via the ribosomal protein s7-mdm2-p53pathway.Carcinogenesis，32(12)，1890-1896.)的生长和增殖。我们还曾发现重组FIP-gat具有抑制人乳腺癌细胞MDA-MB-231生长的作用(Xu，H.，Kong，Y.Y.，Chen，X.，Guo，M.Y.，Zhou，X..(2016).Recombinantfip-gat，a fungal immunomodulatoryproteinfromganoderma atrum，induces growth inhibition and cell death in breast cancercells.Journal of Agricultural and Food Chemistry，64(13).)，通过芯片分析，发现经重组FIP-gat处理， MDA-MB-231中有669个差异表达的基因，它们的倍数变化至少在2倍以上，与细胞凋亡相关的基因，如TNFSF8、DRD1、SMPD1和BCL-2也均发生了上调。据研究发现，通过基因工程手段，利用酵母表达系统生产的重组FIP-glu在一定的范围内对鼠源巨噬细胞RAW264.7具有毒性，该研究结果进一步使得FIP在医药领域的应用受到了极大的限制。