[发明专利]APEC双sRNA基因缺失菌株及由其制备的弱毒疫苗

说明书

本发明公开了一株APEC双sRNA基因缺失菌株及由其制备的弱毒疫苗，APEC双sRNA基因缺失菌株的构建方法为Red同源重组方法对RyhA和GcvB双sRNA基因进行敲除，得到禽致病性大肠杆菌FY26ΔryhA/gcvB，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC M 2020611。本发明缺失株具有很好的生物安全性和免疫原性，且毒性较弱，可用于制备禽致病性大肠杆菌弱毒疫苗，预防禽致病性性大肠杆菌感染。本发明禽致病性大肠杆菌FY26ΔryhA/gcvB制备的弱毒疫苗，针对禽致病性大肠杆菌感染具有免疫保护力，攻毒免疫保护效果好。

技术领域

本发明属于微生物领域，具体涉及一株APEC双sRNA基因缺失菌株及由其制备的弱毒疫苗，尤其涉 及一株禽致病性大肠杆菌RyhA和GcvB双sRNA基因缺失菌株及由其制备的弱毒疫苗。

背景技术

禽致病性大肠杆菌(APEC)主要通过呼吸道感染禽类，致病力较强的APEC病原可以突破肺脏的免 疫防御进入血液，引起败血症，从而导致禽类的多系统混合感染，甚至引起禽急性死亡。随着我国养禽业 的发展，禽大肠杆菌病已成为危害养禽业最严重的细菌性传染病之一，该病的发病率为11％-69％，死亡率 为3.8％-72.9％，对养禽业造成巨大损失，对食品安全构成极大威胁。目前APEC的致病机制尚未阐明，且 无有效的疫苗防疫禽大肠杆菌病，仅依靠抗生素等药物控制禽大肠杆菌病，导致APEC分离株耐药性不断 增加及禽产品存在药物残留的风险。

近年来，研究发现致病菌毒力因子的表达调控同样发生在mRNA翻译水平，这种调控被称为转录后调 控(Post-transcriptional Regulation)，而操纵转录后调控的元件是一类小的非编码调控性RNA(Small Non-coding Regulatory RNAs)，简称sRNA。sRNA作为转录后调节分子普遍发现于原核生命体，不同种类 的sRNA碱基长度多样，但长度范围普遍在50bp至500bp之间。sRNA往往与细菌致病力直接相关，一些 新发现的sRNA参与致病菌在感染状态下的压力应答。调控性sRNA与致病菌一系列致病代谢基因表达密 切相关。研究指出，sRNA RyhA能转录后调控大肠杆菌氨基酸代谢，其能调节芳香族氨基酸合成相关基因的表达。sRNA GcvB同样能够调控大肠杆菌氨基酸代谢和转运。尽管传统的灭活疫苗和亚单位疫苗一直在 沿用，但由于免疫效果不佳，免疫途径不方便而逐渐被弱毒活疫苗所取代。制约弱毒疫苗研制的一个关键 因素是缺少具有良好免疫原性、毒力低的疫苗株。因此筛选合适的毒力基因，对菌株毒力进行致弱、减毒 是获得疫苗株的技术手段备受关注。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一株免疫原性好和安全性强的禽致病性大肠杆菌RyhA和GcvB双 sRNA基因缺失菌株及其制备的弱毒疫苗，以达到安全预防禽大肠杆菌病的作用。

为了实现上述目的，本发明使用了如下技术方案：

一株APEC双sRNA基因缺失菌株，所述APEC双sRNA基因缺失菌株为禽致病性大肠杆菌RyhA和 GcvB双sRNA基因缺失株FY26ΔryhA/gcvB，保藏在中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉武汉大学， 保藏编号为CCTCC M 2020611，保藏日期为2020年10月20日，分类命名为Escherichia coli大肠杆菌。

进一步的，所述APEC双sRNA基因缺失菌株的构建方法为：采用Red同源重组的方法对所述禽致病 性大肠杆菌FY26中的RyhA和GcvB双sRNA基因逐一进行敲除，得到所述禽致病性大肠杆菌RyhA和 GcvB双sRNA基因缺失株FY26ΔryhA/gcvB。

进一步的，本发明还提供了一种上述的APEC双sRNA基因缺失菌株在制备防治禽大肠杆菌病的禽致 病性大肠杆菌弱毒疫苗中的应用。

进一步的，本发明还提供了一种上述的APEC双sRNA基因缺失菌株制备得到的禽致病性大肠杆菌弱 毒疫苗。