[发明专利]一种新的自交不亲和油菜种质的创制方法

权利要求书

1.一种利用CRISPR/Cas9编辑BnS6-SMI2创制自交不亲和油菜种质的方法，其特征在于包括下列步骤：

①在隐性亲和系油菜基因组中鉴定出2个SMI2的同源序列：分别命名为BnS6-SMI2和BnS7-SMI2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示；

②根据BnS6-SMI2基因的特异序列设计基于CRISSPR/Cas9的三个sgRNA，sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示；针对三个sgRNA序列设计的引物BnS6-SMI2-sR1-F、BnS6-SMI2-sR1-R、BnS6-SMI2-sR2-F、BnS6-SMI2-sR2-R、BnS6-SMI2-sR3-F、BnS6-SMI2-sR3-R序列如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ IDNO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11所示；

③构建三靶点基因编辑载体pRGEBn-BnS6-SMI2，载体构建所需引物L5AD5-F、L3AD5-R、S5AD5-F、S3AD5-R序列如SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15所示；

④采用农杆菌转化的方式将pRGEBn-BnS6-SMI2载体转至受体材料‘326’中，获得转基因植株；

⑤在转基因后代中筛选阳性苗植株，利用特异引物进行扩增，并将PCR产物送天一辉远生物科技公司进行测序，将测序结果进行比对，确定编辑形式。

2.按权利要求1所述方法在创制甘蓝型油菜自交不亲和性种质资源的应用，其特征在于：

通过CRISPR/Cas9编辑BnS6-SMI2。