[发明专利]一种腈水合活性专一性提高的腈水解酶突变体及其应用

说明书

本发明公开了一种腈水合活性专一性提高的腈水解酶突变体及其应用，所述突变体是将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列第87位、第136位、第224位、第226位进行单突变或多突变获得的。本发明构建的突变体R224S/V226R/I136Q/A87M催化苯乙腈时，反应主产物为苯乙酰胺，酰胺的含量达到91.2％，腈水合活力为OsNIT的113.3％。野生型腈水解酶OsNIT催化苯乙腈时，苯乙酰胺含量为50.6％，同时将OsNIT腈水合活力记为100％。R224S/V226R/I136Q/A87M酰胺含量和水合活力分别为野生型的1.53倍和1.13倍。对腈水解酶的反应专一性调控使其能够应用于酰胺绿色工业催化合成，具有重要意义。

(一)技术领域

本发明涉及一种腈水合活性专一性提高的腈水解酶突变体及其在催化苯乙腈合成苯乙酰胺中的应用。

(二)背景技术

腈化合物是一类含氰基的有机化工原料，广泛用于化工、医药、农药和材料工业。腈水解酶能够催化腈化合物水解生成羧酸，具有独特的化学选择性、立体选择性和区域选择性等优势，在腈化合物转化中发挥重要作用。一些腈水解酶除催化腈化合物水解生成羧酸外，同时具有腈水合活性。如Piotrowski等发现拟南芥腈水解酶同时具有腈水解和腈水合活性，能够催化β-氰基-L-丙氨酸转化为天冬酰胺和天冬氨酸，天冬酰胺的含量高达60％以上(J.Biol.Chem.,2001,276,2616-2621)。此外，Bradyrhizobiumjaponicum腈水解酶催化β-氨基丙腈水解，β-氨基丙酰胺的比例高达33％(J.Mol.Catal.B:Enzym.,2015,115,113-118)。

腈水解酶同时具有腈水解和水合活力的特性使其在生物有机合成中具有巨大潜力。提高腈水解酶的水合活性，可创制新型“腈水合酶”，开辟高效合成β-氨(羟)基酰胺的全新途径。因此，腈水解酶反应专一性的调控对开发腈水解酶生物催化新功能具有重要意义。

随着基因工程技术的迅猛发展，通过分子改造可显著提高腈水解酶的活性、稳定性及底物特异性等催化性能。近年来，腈水解酶反应专一性的调控也成为研究热点。Pseudomonas fluorescensEBC191腈水解酶突变体C163Q明显提高了催化产物中酰胺的比例，并且降低了对(R)-扁桃腈的水解活力(Appl.Environ.Microbiol.,2010,76,3668-3674)。姜水琴等改造Synechocystissp.PCC6803腈水解酶，获得了酰胺比例达73％的突变体F193N，其酰胺合成能力达野生型的35倍，但催化活力为野生型的50％(Catal.Sci.Technol.,2017,7,1122-1128)。张焱等改造水稻(Oryza sativa)腈水解酶OsNIT，突变体Y77E/R224S/V226R以苯乙腈为底物时，酰胺含量达到94.8％(CN111321132A)。进一步研究发现，Y77E/R224S/V226R水合活性仅为野生型的74.35％。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种腈水合活性专一性提高的腈水解酶突变体、编辑基因、工程菌及在合成苯乙酰胺中的应用，对OsNIT进行合成酰胺方向(提高产物中酰胺含量)反应专一性调控，在保持水合活力的同时，提高酰胺含量，降低羧酸含量。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种腈水合活性专一性提高的腈水解酶突变体，所述突变体是将SEQID NO.1所示氨基酸序列第87位、第136位、第224位、第226位进行单突变或多突变获得的。所述突变体可采用易错PCR、定点饱和突变及组合突变构建获得。所述SEQ ID NO.1所示氨基酸序列编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。