[发明专利]Taq DNA聚合酶突变体、PCR反应试剂和试剂盒

权利要求书

1.一种Taq DNA聚合酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.25所示。

2.一种分离的核酸分子，其特征在于，其编码如权利要求1所述的Taq DNA聚合酶突变体。

3.含有权利要求2所述的分离的核酸分子的载体。

4.含有权利要求3所述的载体的重组细胞。

5.一种制备如权利要求1所述的Taq DNA聚合酶突变体的制备方法，其特征在于，其包括：培养如权利要求4所述的重组细胞，从培养产物中分离纯化得到所述Taq DNA聚合酶突变体。

6.一种用于PCR反应的DNA聚合酶试剂，其特征在于，其含有权利要求1所述的Taq DNA聚合酶突变体或其复合物。

7.根据权利要求6所述的DNA聚合酶试剂，其特征在于，所述复合物包括所述Taq DNA聚合酶突变体和结合至抗所述Taq DNA聚合酶突变体的纳米抗体和/或DNA结合蛋白；

优选地，所述纳米抗体源自羊驼、小羊驼、亚洲的西亚骆驼、非洲的单峰驼、南美洲的大羊驼或原驼；

优选地，所述DNA结合蛋白源自古细菌；

优选地，所述DNA结合蛋白源自硫化叶菌属；

优选地，所述DNA结合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.26所示；

优选地，所述DNA聚合酶试剂中，所述Taq DNA聚合酶突变体或其复合物的浓度为1-2U/μl；

优选地，所述DNA聚合酶试剂还含有：18-22mM Tris-HCl、80-120mM KCl、1-3mM二硫苏糖醇、以及30％-50％甘油。

8.一种用于PCR反应的试剂组，其特征在于，其包括权利要求6或7所述的DNA聚合酶试剂以及PCR反应液。

9.根据权利要求8所述的试剂组，其特征在于，所述PCR反应液含有如下组分中的至少一者：Tris-HCl、dNTPs和金属离子；

优选地，所述金属离子为K⁺和/或Mg²⁺；

优选地，所述PCR反应液含有：5-50mM Tris-HCl、30～60mM KCl、2～6mM MgCl₂、以及100～600μM dNTPs；

优选地，所述PCR反应液还含有如下组分中的至少一者：BSA、寡肽、Brij-58、Tween-20以及甲酰胺；

优选地，所述寡肽为六肽；

优选地，所述寡肽的氨基酸序列为：S-F-K-R-G-T；

优选地，所述PCR反应液含有：0.1～10mg/ml BSA、10～20mg/ml寡肽、0.001％～0.5％(w/v)Brij-58、0.005～1％(w/v)Tween-20、1％～5％(v/v)甲酰胺；

优选地，所述PCR反应液含有：8～12mM Tris-HCl、40～60mM KCl、3～5mM MgCl₂、300～600μM dNTPs、0.5～2mg/ml BSA、14～16mg/ml寡肽、0.005％～0.015％(w/v)Brij-58、0.01％～0.02％(w/v)Tween-20、以及2～4％(v/v)甲酰胺；

优选地，所述PCR反应液含有：10.9mM Tris-HCl、54.3mM KCl、4.3mM MgCl₂、543μMdNTPs、1.1mg/ml BSA、15.2mg/ml寡肽、0.01％(w/v)Brij-58、0.015％(w/v)Tween-20、以及3％(v/v)甲酰胺；

优选地，所述PCR反应液的pH为7.5-10，进一步优选为8-9；

优选地，所述PCR反应液还含有检测目标序列的引物；

优选地，在所述PCR反应液中，所述引物的浓度为300-600nM，进一步优选为400-500nM；

优选地，所述PCR反应液还含有检测所述目标序列的探针；

优选地，在所述PCR反应液中，所述探针的浓度为300-600nM，进一步优选为400-500nM；

优选地，所述探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团；

优选地，所述荧光报告基团选自FAM、TET、ROX、VIC、JOE、CY3、CY5和HEX，所述荧光淬灭基团选自DABCYL、ECLIPSE、BHQ-1、BHQ-2和BHQ-3；

优选地，所述PCR反应液含有如下核酸组中的至少一者：由SEQ ID NO.1-3组成的核酸组、由SEQ ID NO.4-6组成的核酸组、由SEQ ID NO.7-9组成的核酸组、由SEQ ID NO.10-12组成的核酸组、由SEQ ID NO.13-15组成的核酸组、由SEQ ID NO.16-18组成的核酸组、由SEQ ID NO.19-21组成的核酸组、以及由SEQ ID NO.22-24组成的核酸组。

10.一种基于PCR反应的检测试剂盒，其特征在于，其含有权利要求1所述的Taq DNA聚合酶突变体、权利要求6或7所述的DNA聚合酶试剂、权利要求8或9所述的试剂组。