[发明专利]一种基于MALDI-TOF-MS体外筛选CDKs家族蛋白激酶抑制剂的方法

说明书

本发明公开了一种基于MALDI‑TOF‑MS体外筛选CDKs家族蛋白激酶抑制剂的方法，包含以下步骤：首先制备CDKs体外磷酸激酶实验缓冲液(KRB)的母液；然后加入待测药物样品进行体外磷酸激酶反应制备质谱分析样品；最后通过MALDI‑TOF‑MS检测来比较样品中磷酸化的短肽和未磷酸化的短肽离子峰的峰面积大小来判断待测药物抑制CDKs的体外活性。本发明所提供的方法是利用药物样品与细胞提取的蛋白激酶在ATP的帮助下进行体外磷酸化对应的底物短肽，然后利用质谱检测出磷酸化的短肽和未磷酸化的短肽，两者的峰面积比反映了抑制CDKs的活性大小。发明所提供的方法采用体外实验和MALDI‑TOF‑MS检测磷酸化结果，样品需求少，药物用量少，不用进行复杂的细胞实验，还可进行大规模的样品筛选。

技术领域

本发明属于氨基代谢物同分异构体鉴定领域，具体涉及一种基于MALDI-TOF-MS体外筛选CDKs家族蛋白激酶抑制剂的方法。

背景技术

细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinases，CDKs)由于受周期蛋白cyclin的激活而得名，是一组丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。智人基因组的完整序列表明，在30000个预测基因中，有13个CDK和25个Cyclins。11个CDKS及其相关的Cyclins在人类中已被鉴定。

在众多的激酶中，CDKs由于其作用的复杂性，参与了许多重要的细胞过程。它们调节细胞分裂、凋亡、转录和分化，这涉及许多疾病，如人类的各类癌症，艾滋病等。CDKs的不同亚型在细胞分裂、凋亡、转录和分化的过程中所起的作用不尽相同，根据其在细胞周期进展和转录调控中的作用大概分为两组，第一组包括CDK亚型1、2、4、6等，主要参与细胞周期，第二组包括CDK亚型7、8、9等，与转录控制相关¹。

CDKs中CDK4/6与Cyclin D结合形成CDK4/6-Cyclin D复合物，是细胞周期激活的重要组成部分，并介导细胞从G1期过渡到S期，在S期细胞生长并合成蛋白质，为合成DNA做准备²。在转录性CDKs中，CDK9引起了许多群体的关注。CDK9与Cyclin T或Cyclin K形成异源二聚体复合物，使RNA聚合酶II(RNAPII)的羧基末端结构域(CTD)磷酸化，从而控制转录进程³。CDK9和Cyclin T1组成正转录延伸因子b(P-TEFb)，它能刺激大多数蛋白编码基因的转录延伸⁴。

在癌症的治疗中，由于CDKs在控制细胞分裂中的重要作用，许多针对CDKs的药物被设计并在进行临床试验。近年来有几种CDK抑制剂已经通过了FDA的批准，他们基本都是选择性CDK4/6抑制剂。美国FDA于2015年2月批准了首个用于治疗HR+/her2乳腺癌的CDK抑制剂，辉瑞公司的palbociclib⁵。诺华的ribociclib和礼来的abemaciclib也分别于2017年3月和9月获得FDA的快速批准，用于治疗HR+/her2乳腺癌^6,7。而据报道，作为CDK4/6选择性抑制剂的palbociclib和ribociclib都需要与来曲唑联合治疗乳腺癌^8,9。Abemaciclib具有额外的激酶活性，如对CDK1、CDK2和CDK9的抑制活性¹⁰。

在各种癌症中都可以观察到CDK-Cyclin通路调节失调，导致无节制增殖¹¹，但目前只有基于抑制CDK4/6的治疗乳腺癌药物获批上市，这既为用CDKs作为靶点治疗各种癌症提供了希望和动力，同时也说明寻找一个高通量的CDK抑制剂筛选方法具有重要的意义。MALDI-TOF-MS(基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱)的主要组成为基质辅助激光解吸电离离子源(MALDI)和飞行时间质量分析器(TOF)，具有速度快、准确度高、分辨率高及灵敏度高等特点。相比其他质谱，MALDI-TOF-MS的简单、快速、准确和低成本是其最大的优势，我们将提供一种基于MALDI-TOF-MS体外筛选CDK家族的ATP竞争性抑制剂的方法。

参考文献