[发明专利]一种突变酶SHP2 E76K的活性检测方法

权利要求书

1.一种突变酶SHP2 E76K的活性检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、化合物配制添加，将待测化合物用100％DMSO稀释作为第一个浓度，然后再进行第二个浓度点稀释至第八个浓度点，用1X buffer将待测化合物各梯度稀释成DMSO为10％的工作液，取5uL每孔加到对应孔中，设置双复孔实验，每孔加入18uL配制的反应混合液；

步骤2、SHP2 E76K酶添加，用1X assay buffer将SHP2 E76K酶稀释到2ng/uL，取2uL每孔加入到对应孔中，化合物与酶在相应温度下进行预孵育；

步骤3、底物添加，化合物预孵育结束后每孔加入25uL底物工作液，DMSO终浓度为1％；

步骤4、总体系反应，反应体系置于在相应温度下进行反应，反应结束后采用多标记分析仪读取Fluorescence、excitation:360nm、emission:460nm；

步骤5、化合物本底读值检测，未避免化合物本身带有的荧光值对数据产生影响，需要检测化合物本身的荧光读值，取100％DMSO稀释好的待测化合物各梯度0.5uL到新的化合物板中，加入49.5uL ddH2O进行100倍稀释，此时DMSO终浓度为1％，采用多标记分析仪读取Fluorescence、excitation:360nm、emission:460nm。

2.根据权利要求1所述的一种突变酶SHP2 E76K的活性检测方法，其特征在于：所述步骤1中，稀释的浓度为1-3mM，所述梯度稀释为最高浓度点稀释的2-5倍。

3.根据权利要求1所述的一种突变酶SHP2 E76K的活性检测方法，其特征在于：所述骤1中，反应混合液包括12.5uL H2O、5uL 5X assay buffer、0.5uL DTT，其中0.5uL DTT为250mm。

4.根据权利要求1所述的一种突变酶SHP2 E76K的活性检测方法，其特征在于：所述步骤2中，化合物预孵育的温度为20-30度，且孵育时间为30-90分钟。

5.根据权利要求1所述的一种突变酶SHP2 E76K的活性检测方法，其特征在于：所述步骤3中，底物工作液包含19.45uL H2O、5uL 5X assay buffer、0.5uL DTT和0.05uL SHP-2Substrate DiFMUP。

6.根据权利要求5所述的一种突变酶SHP2 E76K的活性检测方法，其特征在于：所述DTT和SHP-2Substrate DiFMUP分别为250mM和10mM。

7.根据权利要求1所述的一种突变酶SHP2 E76K的活性检测方法，其特征在于：所述步骤4中，反应体系在20-30度温度下反应20-60分钟。

8.根据权利要求1所述的一种突变酶SHP2 E76K的活性检测方法，其特征在于：所述步骤5中，得出酶反应原始读值减去化合物荧光读值后得到的数据作为抑制率计算的初始值，其计算方式以下；

利用方程式(Sample-Min/Max-Min)*100％将初始值换算成抑制率，IC50的值即可通过四参数进行曲线拟合得出(GraphPad Prism中log(inhibitor)vs.response--Variableslope模式得到)。