[发明专利]改善Taq DNA聚合酶耐受性的突变体及制备方法和应用

权利要求书

1.一种改善Taq DNA聚合酶耐受性的突变体，其特征在于，所述的突变体位于Taq DNA聚合酶的肽链C端由424-832个氨基酸构成第二个结构域，所述的第二结构域表达5’-3’DNA聚合酶活性；所述突变体在SEQ ID No.1所示的序列中，具有下述的一个或多个氨基酸位置上的氨基酸取代，其中数字表示突变氨基酸的位置，数字前的字母对应突变涉及的氨基酸，数字后的字母表示用于置换数字前氨基酸的氨基酸类型：S623N、R704S、A705L。

2.根据权利要求1所述的改善Taq DNA聚合酶耐受性的突变体，其特征在于，所述突变体是S623N和A705L的组合突变；或所述突变体是S623N和R704S的组合突变；或所述突变体是S623N、R704S、A705L的组合突变。

3.根据权利要求1所述的改善Taq DNA聚合酶耐受性的突变体，其特征在于，所述的改善Taq DNA聚合酶耐受性的突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，或与SEQ ID NO.2所示序列具有至少70％同一性的具有Taq DNA聚合酶活性的氨基酸序列。

4.一种改善Taq DNA聚合酶耐受性的突变体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

以Taq DNA聚合酶的基因表达序列为扩增模板，并加入点突变引物进行点突变PCR扩增，得到目的基因表达序列；其中，所述目的基因表达序列所编码得到的蛋白质与所述野生型Taq DNA聚合酶相比，具有S623N、R704S、A705L突变；将所述目的基因表达序列转化到宿主细胞中，并对转化后的所述宿主细胞进行诱导表达，得到所述改善Taq DNA聚合酶耐受性的突变体。

5.根据权利要求4所述的改善Taq DNA聚合酶耐受性的突变体的制备方法，其特征在于，所述点突变引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的序列为：5’-CTCGCCCACCTCGGCGATGAAAAT-3’，所述反向引物的序列为：5’-ATTTTCATCGCCGAGGTGGGCGAG-3’。

6.根据权利要求4所述的改善Taq DNA聚合酶耐受性的突变体的制备方法，其特征在于，所述点突变引物包括正向引物和反向引物，正向引物的序列为：5’-TCTTTCCCGAAGGTTTGGATCGAAAAAACG-3’，反向引物序列为：5’-CGTTTTTTCGATCCAAACCTTCGGGAAAGA-3’。

7.一种利用改善Taq DNA聚合酶耐受性的突变体制备的直扩扩增试剂盒，其特征在于，包括如下组分：改善Taq DNA聚合酶耐受性的突变体、反应液、PCR增强剂以及dNTP；

所述的改善Taq DNA聚合酶耐受性的突变体为权利要求1-3任一项所述的突变体；或由权利要求4-6任一项所述的制备方法制得的突变体；

所述反应液为：10-50mmol/L Tris-HCI、1-5mmol/L MgC1₂、0.1-1％Brij-58、40-200mmol/L(NH4)₂SO₄,pH7.5-9.5；

所述的PCR增强剂为甘油、DMSO和甜菜碱中的至少一种。