[发明专利]一种HB-NC4重组蛋白及其制备方法与应用在审
| 申请号： | 202011602310.2 | 申请日： | 2020-12-29 |
| 公开（公告）号： | CN113024675A | 公开（公告）日： | 2021-06-25 |
| 发明（设计）人： | 李妍;汪亚娅;王福文;李连;牟艳玲 | 申请（专利权）人： | 山东第一医科大学（山东省医学科学院） |
| 主分类号： | C07K19/00 | 分类号： | C07K19/00;C12N15/70;A61K38/18;A61K38/39;A61P19/02;A61P29/00 |
| 代理公司： | 济南信达专利事务所有限公司 37100 | 代理人： | 罗文曌;刘凯 |
| 地址： | 250117 山东*** | 国省代码： | 山东;37 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 hb nc4 重组 蛋白 及其 制备 方法 应用 | ||
1.一种HB-NC4重组蛋白，其特征在于该重组蛋白是由NC4人源胶原蛋白IX的N末端非胶原结构域4、HB肝素结合结构域重组构成。
2.一种HB-NC4重组蛋白，其特征在于：该重组蛋白的氨基酸残基序列如SEQ ID NO.1。
3.一种HB-NC4重组蛋白，其特征在于：带有His标签的该重组蛋白氨基酸残基序列如SEQ ID NO.2。
4.一种HB-NC4重组蛋白，其特征在于：编码该重组蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.3，或其具有遗传密码简并性的序列。
5.根据权利要求4所述的一种HB-NC4重组蛋白，其特征在于：编码该重组蛋白的核苷酸序列中，
编码肝素结合结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO.4，或其具有遗传密码简并性的序列；
编码的人源胶原蛋白IX的N末端非胶原结构域4的核苷酸序列如SEQ ID NO.5，或其具有遗传密码简并性的序列。
6.一种重组质粒，其特征在于：该质粒的核苷酸序列包含有如权利要求4所述的一种HB-NC4重组蛋白的核苷酸序列。
7.一种如权利要求1～4所述HB-NC4融合蛋白的制备方法，其特征在于：
(1)融合基因的构建：制备含有编码NC4的目的基因和编码HB的目的基因的HB-NC4融合基因，并扩增；
(2)采用限制性内切酶Bam HⅠ、XhoⅠ分别酶切质粒pET28a，并回收酶切产物，采用重组克隆试剂盒连接酶切质粒和HB-NC4融合基因；
(3)将步骤(2)的连接产物转化入大肠杆菌DH5a感受态细胞，筛选阳性克隆并用PCR及DNA测序分析鉴定重组质粒pET28a/HB-NC4，并获得最终重组表达质粒pET28a/HB-NC4；
(4)采用热激法将表达质粒转化入大肠杆菌感受态细胞中，在含有硫酸卡那霉素的LB平板上培养，筛选转化子单菌落并抽提质粒进行PCR验证，获得阳性转化子；
(5)将上述阳性转化子发酵，分离纯化得到发酵产物，鉴定发酵产物即为pET-HB-NC4重组蛋白。
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