[发明专利]肿瘤相关抗原p62/IMP2对食管鳞癌影响的研究方法

权利要求书

1.一种肿瘤相关抗原p62/IMP2对食管鳞癌影响的研究方法，其特征在于，包括：

步骤一、检测p62/IMP2在ESCC中的表达特征；

步骤二、构建稳定过/低表达p62/IMP2的稳定细胞株；

步骤三、观察p62/IMP2在食管鳞癌中的作用；

在所述步骤三中，包括步骤：

3.1、确定过表达p62/IMP2对ESCC细胞增殖的影响；

3.2、确定过/低表达p62/IMP2对ESCC细胞迁移的作用；

3.3、确定过/低表达p62/IMP2对ESCC侵袭的作用；

3.4、确定过/低表达p62/IMP2对ESCC细胞凋亡的作用；

3.5、确定过/低表达p62/IMP2对ESCC细胞化疗耐药的作用；

3.6、确定p62/IMP2在体内促进ESCC的形成。

2.根据权利要求1所述的肿瘤相关抗原p62/IMP2对食管鳞癌影响的研究方法，其特征在于，

在所述步骤一中：

利用p62/IMP2多克隆抗体检测正常食管组织、癌旁组织和食管鳞癌组织中p62/IMP2的表达特征；

优选地，通过免疫组织化学染色，检测p62/IMP2在不同组织中的表达水平。

3.根据权利要求1所述的肿瘤相关抗原p62/IMP2对食管鳞癌影响的研究方法，其特征在于，

在所述步骤二中，包括步骤：

2.1、研究p62/IMP2在不同食管鳞癌细胞中的表达，并选定细胞构建细胞模型；

2.2、构建稳定过/低表达p62/IMP2的ESCC细胞株；

优选地，选取Eca109细胞通过慢病毒感染构建过表达p62/IMP2的食管癌细胞模型；

优选地，选取KYSE150细胞通过慢病毒感染构建稳定低表达p62/IMP2的细胞模型。

4.根据权利要求1所述的肿瘤相关抗原p62/IMP2对食管鳞癌影响的研究方法，其特征在于，

在所述步骤3.1中：

将ESCC细胞转移至96孔板上，并在37℃恒温、5％CO₂的环境下培养；

每隔24小时，连续4天在同一时间采用CCK8试剂盒测定细胞增殖情况，用酶标仪测定吸光度读值(波长为450nm)，绘制增殖曲线，根据增殖曲线确定过表达p62/IMP2对ESCC细胞增殖的影响。

5.根据权利要求1所述的肿瘤相关抗原p62/IMP2对食管鳞癌影响的研究方法，其特征在于，

在所述步骤3.2中：

取Eca109-vector、Eca109-p62+、KYSE150-control和KYSE150-p62-细胞，细胞浓度为1×10⁵，对细胞培养并使得细胞的融合率达到100％；

在平板上采用画十字方式布置细胞，采用PBS轻柔洗细胞3次去除漂浮细胞，置于倒置显微镜下拍照测量，为0点的样本，之后将轻柔洗后的细胞在恒温37℃、5％CO₂的环境中培养，培养一段时间后，观察细胞发育结构确定过/低表达p62/IMP2对ESCC细胞迁移的作用。

6.根据权利要求1所述的肿瘤相关抗原p62/IMP2对食管鳞癌影响的研究方法，其特征在于，

在所述步骤3.3中：

将Matrigel基底膜基质胶融化，用无血清培养基配制基质胶，比例为培养基∶基质胶＝1∶7；

将配好的胶铺到Costar24孔Transwell上室，放置于培养箱使其成胶状；

处于对数期的细胞用无血清的培养基悬浮，上室每孔加入100μl细胞悬液，在下室中加入600μl含10％胎牛血清的培养基，并在恒温37℃、5％CO₂的环境中培养；

用含10％甲醇的结晶紫染色小室30分钟，将小室放入水中冲洗几遍，再用棉棒擦去上室内部膜表面的细胞，用正置显微镜拍照，33％醋酸洗脱细胞，利用酶标仪测其OD570，分析统计结果确定过/低表达p62/IMP2对ESCC侵袭的作用。