[发明专利]一种采用复合因子法建立健康SD雄性大鼠肝纤维化方法

权利要求书

1.一种采用复合因子法建立健康SD雄性大鼠肝纤维化方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1：血干细胞的培养

采用肠道血加入PBS稀释，取50ml离心管加入10ml淋巴细胞分离液，缓慢加入稀释的肠道血，将分层中间白色云雾状的淋巴细胞层缓慢吸出，加入PBS，离心5分钟，离心后弃上清，再次加入胎牛血清，混匀，重复离心一次；弃上清，加入培养基，混匀后置于100cm²的培养瓶中培养；

S2：干细胞活性物的制备

取培养的干细胞消化计数，胎牛血清洗涤3次，溶于30ml生理盐水中，超声破碎细胞；使细胞内的蛋白及营养成分充分溶出，10分钟离心后取上清，去掉细胞碎片，超滤膜浓缩，去掉免疫球蛋-白，取过滤液，用滤膜过滤无菌，定浓度为200μg/ml，4℃保存，得A液；

培养细胞用的测培养基的PH值为5.5时的上层培养液30ml，用滤膜过滤，使其体积浓缩至5ml左右取出，加入5ml生理盐水，定容至10ml；用0.22μm的滤膜过滤，使其无菌，测蛋白浓度，定浓度为200μg/ml，4℃保存，得B液；

按1：1：1比例将上述A、B和血吸虫血细胞混合，得到血干细胞活性物；

S3：将成年SD雄性大鼠进行喂养培养；

S4：喂养1周，测定体重后的大鼠开始投喂高脂CDAA饲料，并注射血干细胞活性物，一周内其中2天为注射血干细胞活性物，另5天为普通饮水，连续培育8周；

S5：饲养期间每天观察大鼠精神状态、毛发情况，测量进食量和饮水量，每周测量大鼠体重，从第一次投喂高脂CDAA饮食和注射血干细胞活性物开始计算，连续培育饲8周，即得到肝纤维化的大鼠。

2.根据权利要求1所述的一种采用复合因子法建立健康SD雄性大鼠肝纤维化方法，其特征在于：S3中还包括将SD雄性大鼠置于室温25-30℃、湿度55％-65％的笼子中，在12小时的光照/黑暗周期，适应性喂养1周，测定大鼠体重。

3.根据权利要求2所述的一种采用复合因子法建立健康SD雄性大鼠肝纤维化方法，其特征在于：S4中的高脂CDAA饲料，其中，以重量计：脂肪32％、碳水化合物55％、蛋白质13％，胆碱为0；碳水化合物为淀粉、糊精、糖、蛋白质为氨基酸预混料，脂肪为玉米油和氢化植物油，热量为4.3千卡/g。

4.根据权利要求1所述的一种采用复合因子法建立健康SD雄性大鼠肝纤维化方法，其特征在于：所述S1中还包括以下步骤：

S11：细胞生长到80-90％培养瓶底时，吸出培养基，加入PBS冲洗，吸出PBS，加入胰酶，加入含20％胎牛血清的α-MEM培养基，中和胰酶，吸出中和液，放入离心管中，加入PBS，离心5分钟，离心后去上清，加入PBS，混匀，重新离心一次，细胞计数，每瓶加入2×105细胞，置入100cm²的培养瓶中培养。

5.根据权利要求1所述的一种采用复合因子法建立健康SD雄性大鼠肝纤维化方法，其特征在于：还包括S5：

利用SD雄性大鼠肝穿刺组织标本在未经任何化学特殊染色的情况下，直接给予胶原特异性激发光谱直接激发离体肝组织，利用荧光显微镜的特殊荧光激发块系统观察肝组织固有荧光特征，而做出肝纤维化程度的诊断。

6.根据权利要求5所述的一种采用复合因子法建立健康SD雄性大鼠肝纤维化方法，其特征在于：S5中的特殊荧光激发块激发光波长分布在较低范围300nm-460nm之间内，用于肝纤维化诊断的肝组织切片是未进行任何染色的肝组织切片。

7.根据权利要求6所述的一种采用复合因子法建立健康SD雄性大鼠肝纤维化方法，其特征在于：还包括肝纤维化诊断系统，所述肝纤维化诊断系统是针对肝组织切片包括冰冻切片、石蜡包埋切片，在未经过任何化学染色或荧光标记的情况下，在较低波长范围300nm-460nm之间的滤光片，或其他相应光源的激发光激发后所产生的肝组织固有荧光。

8.根据权利要求7所述的一种采用复合因子法建立健康SD雄性大鼠肝纤维化方法，其特征在于：S5中的肝纤维化诊断系统包括任何借助于该波长范围在300nm-460nm之间及肝组织标本的固有荧光特征，进行肝纤维化程度判定。