[发明专利]一种快速测定IL-2蛋白药物和抗CD25抗体药物的生物学活性方法

说明书

本发明公开了一种快速测定IL‑2蛋白药物和抗CD25抗体药物的生物学活性方法，所述方法通过构建慢病毒(pLV‑STAT5‑Luc‑PGK‑Zencin)转染的C8166效应细胞，经筛选后得到稳定表达STAT5报告基因的单克隆细胞株，用IL‑2蛋白药物刺激激活报告基因的表达，并用抗CD25抗体药物阻断IL‑2刺激激活的信号通路，根据测定的信号值拟合四参数曲线测定IL‑2蛋白药物及抗CD25抗体药物的生物学活性。本发明提供的检测方法可评价药物对细胞信号下游的相关指示、无需任何人原代组织来源的细胞或其他组分、显色稳定、实验周期短、操作简便、成本低。

技术领域

本发明属于生物药物的生物学活性检测领域，具体而言，涉及一种快速测定IL-2蛋白药物和抗CD25抗体药物的生物学活性方法。

背景技术

治疗性单克隆抗体(简称单抗)作为一种重要的生物技术产品，具有特异性高、靶向性强、疗效确切等优点，是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体，目前，其在治疗肿瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病及移植排斥反应中取得了显著的疗效。2018年，单抗药物的销售额占全球生物药市场的比重高达55.3％。此外，在2019年全球销售额前二十的药品中，13个生物药中单抗药物就占据9席，目前单抗药物是全球制药最重要的细分领域之一，也已经成为全球医药市场的重要组成部分。

面对抗体类药物的快速发展，迫切需要建立相应的抗体药物质量评价技术体系，而细胞水平上的生物学活性的测定是对药物的有效成分和含量以及药物效价测定的最有效的方式之一，也是确保抗体类药物有效性的重要质控指标，因此，其在抗体类药物的发现和开发中发挥着重要的作用。目前，生物学活性检测的方法多采用基于细胞的生物学活性测定方法，主要包括细胞增殖抑制法、细胞毒性法、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性法、补体依赖的细胞毒性法和细胞竞争ELISA法。

白细胞介素2(IL-2)是T细胞和NK细胞产生的15.5kD糖蛋白，主要由CD4⁺ T细胞产生，其他免疫细胞如CD8⁺ T细胞、NK细胞也可产生少量的IL-2。IL-2于1976年被发现，其能够维持T细胞在体外的长期生长，故被称为T细胞生长因子，1979年第二届国际淋巴因子研讨会统一将其命名为IL-2。IL-2通过白细胞介素-2受体(IL-2R)发挥其生理作用，IL-2R是一组不同的复合体，按其对IL-2亲和力不同被分为低、中、高亲和力受体，这些受体均由IL-2Rα(CD25)、IL-2Rβ(CD122)、IL-2Rγ(CD132)三种亚基中的一个或多个亚基构成。目前临床上广泛用于肿瘤、病毒性肝炎等治疗，疗效显著。

目前，中国药典上采用CTLL-2检测IL-2蛋白药物的生物学活性，该细胞为悬浮细胞，细胞复苏后约3周可用于分析。另外，细胞复苏时需在完全培养基中添加10％CTLL-2细胞上清，平时培养过程中需要预留上清备用。细胞培养液为RPMI 1640+10％FBS+1％青链霉素+100IU/mL IL-2，此方法周期约为3～4天，第一天将细胞铺板前洗涤3遍以上，铺板后加样，37℃，5％CO₂条件下培养18～24小时。加MTT溶液4～6小时后加裂解液，继续在37℃，5％CO₂条件下培养18～24小时，全程无菌操作。将细胞液混匀，酶标仪读数，记录测定结果。该方法存在检测周期长、操作繁琐等缺陷。

抗CD25单克隆抗体作为新的免疫抑制剂的代表，特异性地作用于CD25，通过阻断T细胞的活化与增殖，能够有效降低急性排斥反应的发生率，显著提高移植物及移植受体的生存率，降低激素用量和缩短其使用时间。目前巴利昔单抗、达利珠单抗及相关的生物类似药的生物学活性的检测采用的方法有竞争ELISA法和流式细胞法，其中，竞争ELISA法检测抗CD25单克隆抗体的生物学活性时，无法反映下游信号通路，进而无法评估用于放行检验的稳定指示的适用性；流式细胞法检测抗CD25单克隆抗体的生物学活性时，需要相关的设备和大量的耗材，为企业增加了经济负担。