[发明专利]具有特异性分子靶标的食源性致病菌标准菌株活菌的检测方法及应用有效
| 申请号： | 202011608299.0 | 申请日： | 2020-12-30 |
| 公开（公告）号： | CN112538544B | 公开（公告）日： | 2022-06-14 |
| 发明（设计）人： | 吴清平;张菊梅;丁郁;薛亮;陈谋通;相欣然;王涓;叶青华;吴诗;曾海燕;杨小鹃;张淑红;庞锐;雷涛;古其会;韦献虎;张友雄;陈鲁 | 申请（专利权）人： | 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心）;广东环凯生物科技有限公司 |
| 主分类号： | C12Q1/689 | 分类号： | C12Q1/689;C12Q1/6851;C12Q1/14;C12Q1/10;C12Q1/06;C12N15/11 |
| 代理公司： | 广州三环专利商标代理有限公司 44202 | 代理人： | 颜希文;周全英 |
| 地址： | 510070 广东省广州*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 具有 特异性 分子 靶标 食源性 致病菌 标准 菌株 检测 方法 应用 | ||
1.用于检测食源性致病菌的特异性分子靶标组合，其特征在于，所述特异性分子靶标组合的核苷酸序列见表格所示：
2.检测如权利要求1所述的特异性分子靶标组合的引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列见表格所示：
3.一种非诊断和治疗目的检测食源性致病菌活菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：在待测样品加入PMA染料溶液；
步骤2：提取待测样品中的菌体DNA；
步骤3：以步骤2中的菌体DNA为模板，进行实时荧光定量PCR检测；
步骤4：待反应结束后，将获得的荧光定量PCR扩增的曲线和Ct值与建立的标准曲线计算样品中食源性致病菌活菌的数量；
其中，所述步骤3中进行实时荧光定量PCR检测所使用如权利要求2所述的引物。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤3中实时荧光定量PCR检测扩增的目的片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：1～14及SEQ ID NO：19～31所示。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤1所述待测样品中的食源性致病菌菌体浓度控制在1×104～1×106cfu/mL范围内。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤1具体操作如下：在待测样品中加入PMA溶液，将其置于37℃恒温培养箱中避光培养5min，用500W钨丝灯照射10min，该步骤的目的是为了使死菌或细胞膜破损的菌的DNA与PMA交联，使其不能进行PCR扩增。
7.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述PMA终浓度为2～16mg/mL。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述PMA终浓度为16mg/mL。
9.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤2待测样品中的菌体DNA采用磁珠法提取菌悬液中的DNA。
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