[发明专利]一种内源性癫痫发作动物模型及其构建方法

说明书

本发明公开一种内源性癫痫发作动物模型，包含采用化学遗传学或光遗传学激活病毒注射到小鼠的海马CA3区，表达3周后建成，所述激活病毒选自：a)rAAV‑CaMKIIa‑hM3D(Gq)‑mCherry‑WPREs‑pA与rAAV‑VGAT1‑hM3D(Gq)‑mCherry‑WPRE‑pA的混合物，和b)rAAV‑Ef1α‑DIO‑hChR2(H134R)‑EYFP‑WPRE–pA与rAAV‑CaMKII‑CRE‑WPRE‑pA和AAV‑VGAT1‑CRE‑WPRE‑pA的混合物。该癫痫发作动物模型相对于CA1区和VA区多点注射模型更适合于癫痫的机制研究及抗癫痫药物的筛选。

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及一种内源性癫痫发作动物模型及其构建方法，特别涉及一种采用化学遗传学或光遗传学激活病毒构建的内源性癫痫发作动物模型及其构建方法。

背景技术

难治性癫痫近40年来均未取得明显进展。其原因在于对发病机制尚不完全清。既往对癫痫发病机制的探讨多基于传统的癫痫动物模型，如皮罗卡品、海仁酸或电刺激等，这些外源性的癫痫动物模型与人类的癫痫发作存在巨大的差异。癫痫发作过程中参与的脑区或具体参与的神经元亦不明确。因此，这些外源性癫痫模型尚不能完全模拟人类的癫痫发作。现有观点认为人类癫痫的发生可能与谷氨酸和γ-氨基丁酸能神经元有关，而这两种神经元是脑内主要的神经元，目前应用于抗癫痫治疗的新药及物理疗法几乎都与这两种神经元有关，提示这两种神经元可能与癫痫的发病机制有关。随着光遗传学和化学遗传学(DREADDs)方法学越来越多的应用于神经科学，需要通过内源性调控的方法来构建新型的、通用的、可靠的癫痫发作模型，使其更适合于癫痫发病机制的研究及抗癫痫药物的筛选。有望成为扭转目前治疗上被动局面的有效措施。

传统模型的缺点：传统的点燃模型存在一系列问题。第一，例如，匹罗卡品、海人酸及PTZ模型，使用扩散的化学药品本身是可变的，不能精确地查明发病区域和细胞类型，很难区分可塑性机制对组织损伤的贡献。第二，实验者无法控制点燃后激活的细胞子集，从而难以在细胞类型与病理结果之间建立因果关系。缺乏特异性可能反过来导致整个实验室的标准化结果降低。并且这类模型反复进行点燃后，化学物质对脑组织损坏亦严重，部分研究领域实验数据可靠性降低。

CN111839800公开一种化学遗传癫痫持续状态疾病动物模型及其构建方法与应用，所述癫痫持续状态疾病动物模型为小鼠脑内核团(模型一海马CA1区和丘脑腹前核VA区；模型二基底外侧杏仁核BLA区和丘脑腹前核VA区)脑立体定位病毒(化学遗传病毒rAAV-CaMKIIa-hM3D(Gq)-mCherry-WPREs-pA)注射和小鼠海马CA3区电极阵列埋置，小鼠恢复1周后，腹腔注射氯氮平的代谢产物CNO，使得CNO与病毒表达的受体结合从而激活神经元诱导癫痫持续状态发作，经行为学观察和在体多通道局部场电位记录判断得到癫痫持续状态疾病动物模型。该模型的构建方法仍存在许多不足。第一，该方法需要在脑内多个点(如CA1区、VA区、BLA区等)注射病毒，才能建立癫痫持续状态模型，但两个或多个核团同时激活，难以同时明确核团上下游关系，在癫痫网络研究中明显受限。第二，在脑内多点注射病毒所建的模型，不利于癫痫发作过程中，神经网络中神经递质演变的研究。第三，同一只小鼠脑内多点注射病毒时间成本较长，病毒量相对较多。如需上下游同时进行病毒注射，容易造成注射过程中小鼠死亡；如分开注射，则延长实验时间，增加时间成本。同时也增加小鼠喂养过程中的费用和成本。第四，该模型为癫痫持续状态模型而非癫痫模型，适合于癫痫持续状态领域研究，而不适合于癫痫的机制研究及抗癫痫药物的筛选。

因此，需要探索有利于癫痫机制研究及抗癫痫药物筛选；且更便于清楚明确核团上下游关系，有利于弄清癫痫网络；同时，操作更简便，保证模型动物的存活率的癫痫发作动物及其构建方法。

发明内容