[发明专利]一种VEGF单克隆抗体、试剂盒、其制备方法和应用

权利要求书

1.一种VEGF单克隆抗体，其特征在于，

VEGF单克隆抗体的重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；

VEGF单克隆抗体的轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的VEGF单克隆抗体，其特征在于，

VEGF单克隆抗体的重链高变区CDR-H1、重链高变区CDR-H2、重链高变区CDR-H3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的VEGF单克隆抗体，其特征在于，

VEGF单克隆抗体的轻链高变区CDR-L1、轻链高变区CDR-L2、轻链高变区CDR-L3氨基酸序列分别为SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列。

4.一种如权利要求1～3任一所述的VEGF单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

一、VEGF蛋白抗原的制备；

二、VEGF多克隆抗体的制备；

三、VEGF单克隆抗体的制备；

四、单克隆抗体筛选：建立剂量反应曲线，筛选最优单克隆抗体；

五、杂交瘤中单克隆抗体基因的调取：

提取杂交瘤细胞的总RNA；

以OligodT为引物，逆转录合成得到cDNA；

以合成cDNA为模板，进行PCR扩增；

获取编码重链可变区基因序列和编码轻链可变区基因序列；

重链可变区基因序列和编码轻链可变区基因序列和抗体的恒定区进行密码子优化并合成，分别获得完整抗体基因的重链和轻链；

将获得的重链和轻链基因分别克隆到pMD18-T表达载体中；

将获得的质粒转染感受态细胞中；

收集细胞上清液，纯化、浓缩后获得VEGF单克隆抗体。

5.根据权利要求4所述的VEGF单克隆抗体的制备方法，其特征在于，PCR扩增的条件为：95℃变性5min，55℃1min，72℃2min，共35个循环；最后再于72℃延伸10min。

6.一种VEGF检测试剂盒，其特征在于，含有权利要求1～3任一所述的VEGF单克隆抗体。

7.一种如权利要求6所述的VEGF检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将VEGF单克隆抗体用缓冲液稀释，加入链霉亲和素磁珠反应；

清洗缓冲液；

加入含胎牛血清的PBS封闭液，反应后进行磁性分离，去除上清液；

用缓冲液清洗后，磁粒悬于含牛血清白蛋白的PBS的保存缓冲液中，制成VEGF包被磁珠；

用VEGF蛋白抗原，按比例稀释多个梯度分装制成VEGF校准品；

将VEGF多克隆抗体加入吖啶酯溶液，避光反应；

反应完毕后取出，加入赖氨酸盐溶液，继续避光反应；

纯化，得到VEGF吖啶酯标抗体；

VEGF包被磁珠中加入血清样本和校准品，再加入VEGF吖啶酯标抗体，温育后即形成抗体-抗原-标记抗体复合物；

分别加入HNO₃、H₂O₂发光激发液A、NaOH、Triton-100发光激发液B，立即放入化学发光免疫检测仪内，检测各孔的发光强度；

根据反应曲线算出样品中VEGF的含量。

8.根据权利要求7所述的VEGF检测试剂盒的制备方法，其特征在于，用PBS、tween-20清洗缓冲液。

9.根据权利要求7所述的VEGF检测试剂盒的制备方法，其特征在于，用G-25脱盐柱纯化，得到VEGF吖啶酯标抗体。

10.一种如权利要求6所述的VEGF检测试剂盒在制备评估VEGF靶向药物疗效检测试剂盒中的应用。