[发明专利]反相高效液相色谱检测帕拉米韦三水合物的方法

说明书

本发明公开了一种反相高效液相色谱检测帕拉米韦的方法，包括以下步骤，制备供试品溶液，采用反相高效液相色谱对供试品进行检测，按面积归一化法计算供试品中单个杂质和总杂质的含量；通过本方法，改变流动相及配比，紫外吸收检测器的波长等，将帕拉米韦与各杂质色谱峰完全分离；本发明具有高特异性、准确度和灵敏度，出峰时间快，检测时间短，检测结果准确、稳定，检测方法简单，具有良好的线性关系，对帕拉米韦能进行更精准的检测和质量控制。

技术领域

本发明涉及一种帕拉米韦的分析方法，尤其涉及一种帕拉米韦三水合物的反相高效液相色谱分析方法。

背景技术

帕拉米韦是一个新颖的环戊烷类抗流感病毒药物，是继扎那米韦(Zanamivir)和奥司他韦(Oseltamivir)研发成功并于1999年上市之后的又一新型流感病毒NA抑制剂。2013年4月5日，国家食品药品监督管理总局批准了抗流感新药帕拉米韦氯化钠注射液，现有临床试验数据证明其对甲型和乙型流感有效。

帕拉米韦合成成品为(1S,2S,3R,4R)-3-((S)-1-乙酰胺-2-乙基丁基)-4-胍-2-羟基环戊烷-1-羧酸，分子式为C₁₅H₂₈N₄O₄·3H₂O，分子量为382.46，结构式如下：

目前市场供应帕拉米韦的厂商较多，质量差异较大，存在一些杂质化合物，一些杂质的存在会严重影响帕拉米韦的质量和用药安全，因此需要对其进行检测和质量控制。帕拉米韦溶解度且存在多个pKa，对于流动相pH的筛选存在较大困难。

发明内容

发明目的：本发明的目的是提供一种方法简单且特异性、准确度和灵敏度高的反相高效液相色谱法对帕拉米韦三水合物进行检测。

技术方案：本发明的帕拉米韦的检测方法包括以下步骤：

(1)制备供试品溶液：称取帕拉米韦用水溶解并稀释，得到浓度为1～3mg/ml的供试品溶液；

(2)色谱柱固定相为嵌入极性酰胺基团的长烷基硅胶；采用紫外吸收检测器；流动相A为磷酸盐缓冲液，流动相B为磷酸盐缓冲液-乙腈混合溶液；洗脱方式为梯度洗脱；

(3)采用反相高效液相色谱对供试品溶液进行检测，进样，梯度洗脱；

(4)按面积归一化计算单个杂质和总杂质的含量。

优选的，步骤(2)中，所述流动相A中磷酸盐为磷酸二氢钾。

优选的，步骤(2)中，色谱柱的规格：内径为3.0～5.0mm，长度为100～250mm，填料粒径为3～5μm。进一步地，色谱柱的规格：内径为4.6mm，长度为250mm，填料粒径为3.5μm。

进一步的，色谱柱为Aglient Zorbax Bonus RP。

优选的，色谱柱柱温为20-50℃，进一步地，色谱柱柱温优选为30℃。

优选的，步骤(2)中，流动相A中的磷酸盐浓度为5～15mmol/l，进一步优选为10mmol。进一步地，流动相B中磷酸盐浓度为5～15mmol/l，进一步优选为5mmol。

优选的，步骤(2)中，流动相B中磷酸盐缓冲液-乙腈混合溶液比例为固定值40:60。

优选的，步骤(2)中，流动相A磷酸盐缓冲液A的pH为4-6，优选为4.5。

优选的，步骤(3)中，进样量为5～100μl，进一步优选为10μl。进一步地，流速为0.9～1.1ml/min，优选为1.0ml/min。

进一步的，紫外吸收检测器的波长为205nm、210nm或215nm的一种，优选为210nm。