[发明专利]一种分枝杆菌的17β-羟基类固醇脱氢酶突变体及其异源表达

说明书

本发明公开了一种分枝杆菌的17β‑羟基类固醇脱氢酶突变体及其异源表达，属于酶基因工程及酶工程领域。本发明提供一种来自于分枝杆菌的放线菌17β‑羟基类固醇脱氢酶17β‑HSDy1及其基因序列，以pMA5为表达质粒，以枯草芽孢杆菌WB600为表达宿主，实现了分枝杆菌LY‑1的17β‑HSDy1的外源表达。对软件模拟获得的该酶关键T239位点，突变成了酪氨酸，酶活提高了19.2％，达到9571.77U·mg^‑1。对突变获得的重组枯草芽孢杆菌WB600‑pMA5‑17βHSDy1‑T239Y进行酶活‑生长曲线的测定，在发酵28h时，重组枯草芽孢杆菌WB600‑pMA5‑17βHSDy1‑T239Y的比酶活达到最高。该异源表达菌株可用于雄甾烯‑1，4‑烯‑3，17‑二酮转化宝丹酮的生产，具有潜在的工业应用。

技术领域

本发明属于遗传工程和发酵工程领域，具体涉及一种来源于分枝杆菌的17β-羟基类固醇脱氢酶突变体及其异源表达。

背景技术

甾体药物是仅次于抗生素的第二大类药物，在医疗领域具有广泛的应用，临床中常用于治疗过敏性疾病、风湿性关节炎、避孕及手术麻醉等。常见的甾体药物中间体分为C19类与C22类，其中以宝丹酮(BD)、雄甾烯-4-烯-3，17-二酮(AD)、雄甾烯-1，4-烯-3，17-二酮(ADD)、9α-羟基雄甾烯-4-烯-3，17-二酮(9α-OH-AD)和睾酮(T)为主的甾体药物中间体在医药领域市场的需求逐年上升。

宝丹酮(BD)是雄激素合成代谢类固醇和睾丸激素(TS)衍生物，可促进蛋白质合成，支持氮保留并刺激肾脏促红细胞生成素释放。BD通常是由雄甾烯-4-烯-3，17-二酮(AD)通过化学合成制得的。然而，微生物转化法具有高立体选择性、绿色环保等优点，在已逐渐在甾体药物中间体的应用中发挥着越来越大的作用，近年来通过生物合成BD成了研究的热点。

17β-羟基类固醇脱氢酶(17β-HSD)，是一类氧化还原酶，能够催化甾体中C-17的羟基与酮基之间的相互转化，反应时需要辅因子NAD(P)H/NAD(P)+。许多微生物可以利用雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD)作为底物通过17β-羟基类固醇脱氢酶还原反应以产生BD，但它们的低底物浓度和转化率不能满足工业生产要求。迄今为止，研究人员共鉴定出15种类型的17β-HSD同工酶，除17β-HSD5属于醛、酮还原酶即AKR超家族之外，其他的同工酶都属于短链脱氢酶/还原酶即SDR超家族。

针对此酶在实际转化甾体药物中间体中的应用，鉴定更多的、高效的17β-羟基类固醇脱氢酶用于宝丹酮的生物转化是具有非常重要的意义。

发明内容

发明目的：本发明的目的在于提供一种来源于分枝杆菌的17β-羟基类固醇脱氢酶突变体及其异源表达，通过对酶活性位点的模拟分析，获得高酶活突变体，并研究了该突变体的相关性质；利用异源表达突变体工程菌成功实现了从雄甾烯-1，4-烯-3，17-二酮(ADD)到宝丹酮的转化。

本发明通过软件模拟获得17β-羟基类固醇脱氢酶的关键活性T239位点，将其突变成了酪氨酸，酶活提高了19.2％。将其突变体在枯草芽孢杆菌异源表达，对该突变体的相关性质进行了研究，用于指导后续的工业化应用。利用该突变体异源表达菌株成功实现了从雄甾烯-1，4-烯-3，17-二酮(ADD)到宝丹酮的转化，为其进一步的工业化应用奠定基础。

本发明的第一个目的是提供一种17β-羟基类固醇脱氢酶突变体，所述的17β-羟基类固醇脱氢酶突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的17β-羟基类固醇脱氢酶的第239位苏氨酸替换为酪氨酸。

进一步地，将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的17β-羟基类固醇脱氢酶的第239位苏氨酸替换为酪氨酸时，突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

所述17β-羟基类固醇脱氢酶的基因来源于分枝杆菌Mycobacterium sp LY-1CGMCC No.13031。