[发明专利]一种突变型丙酮酸氧化酶及其在2-丁酮酸代谢解毒中的应用

说明书

本发明公开了一种突变型丙酮酸氧化酶及其在2‑丁酮酸代谢解毒中的应用，具体涉及一种利用该突变型丙酮酸氧化酶重构乙酸旁路途径增强细胞对2‑丁酮酸耐受性的方法，属于基因工程和微生物发酵技术领域。对丙酮酸氧化酶(PoxB)进行定点饱和突变得到PoxB^F112W突变体，该酶增强了丙酮酸选择性，减弱了2‑丁酮酸结合亲和力。基于此突变体，在微生物细胞TWF115 ΔaceE中重建乙酸旁路，用于L‑苏氨酸的生物合成供应乙酰辅酶A和还原型辅助因子。该重构的乙酸旁路途径可以进一步去除2‑丁酮酸的代谢毒性，帮助宿主菌TWF115 ΔaceE在5g/L的2‑OBA添加下合成更高的L‑苏氨酸(13.98g/L)。

技术领域

本发明涉及一种突变型丙酮酸氧化酶及其在2-丁酮酸代谢解毒中的应用，具体涉及一种利用该突变型丙酮酸氧化酶重构乙酸旁路途径增强细胞对2-丁酮酸耐受性的方法，属于基因工程和微生物发酵技术领域。

背景技术

微生物细胞在其生活和生产过程中经常遭受细胞内有毒代谢产物和不利的环境因素的侵害，例如乙二醛，甲基乙二醛，松柏醛，糠醛等。2-丁酮酸(2-OBA)，也称为2-酮丁酸或α-酮丁酸，属于α-酮酸类的短链酮酸，结构接近丙酮酸。2-OBA是生物代谢必不可少的中间体，从细菌到人类的所有生物物种中都存在。然而，2-OBA在大多数微生物中的积累会导致严重的细胞毒性，包括生长停滞甚至死亡。在L-异亮氨酸，L-2-氨基丁酸，1-丙醇和1-丁醇等这些2-OBA衍生物的生物合成过程中，苏氨酸脱氨酶催化L-苏氨酸分解生成2-OBA，为了避免2-OBA的毒性积累，苏氨酸脱氨酶表达水平往往受到限制，这限制了下游生物合成代谢流量和目标产物生产率的提高。这种类型的生物毒性不仅阻碍发酵菌株的生长，而且阻碍了目标产物的生物合成。迄今为止，还没有系统地阐明2-OBA在微生物中的毒性机理，也没有发现更有效的解决方案来减轻其对微生物细胞的代谢毒性。

前体产物草酰乙酸的充足供应对L-苏氨酸生产菌株高产L-苏氨酸是至关重要，而TCA循环中还原型辅助因子(NADPH和ATP)和α-酮戊二酸的不足是工程大肠杆菌生物合成L-苏氨酸的限制因素。在微生物细胞中，TCA循环利用丙酮酸或乙酰辅酶A通过有氧分解代谢产生多种辅助因子(NADPH、NADH和ATP)。其中，胞内NADH通过吡啶核苷酸转氢酶转化为NADPH，为L-苏氨酸合成供给还原型辅因子。此外，α-酮戊二酸是一种TCA循环中间体，是谷氨酸生物合成的一种前体产物，通过转氨反应参与了微生物中大多数氨基酸的合成，包括L-苏氨酸生物合成。因此，大肠杆菌菌株合成L-苏氨酸的能力受制于进入TCA循环的代谢通量。(图2)

大肠杆菌中与丙酮酸有关的酶促反应和代谢途径早有报道，丙酮酸在大肠杆菌中心代谢途径中的主要分解代谢分支包括丙酮酸脱氢酶复合物(PDHc)，丙酮酸氧化酶(PoxB)和丙酮酸甲酸裂解酶(PflB)。在2-OBA积累过程中，丙酮酸脱氢酶复合物(PDHc)在大肠杆菌中的活性降低，表明2-OBA与丙酮酸之间存在竞争性抑制作用。2-OBA和丙酮酸是三种AHAS同工酶(AHAS I(IlvBN)，AHAS III(IlvIH)和AHAS II)的共同底物，这可能归咎于2-OBA和丙酮酸之间类似的分子结构，所以推测2-OBA可以作为丙酮酸的分子类似物，参与以丙酮酸为底物的酶促反应(图1)。推测2-OBA在体内的过度累积扰乱了丙酮酸或乙酰辅酶A正确参与TCA循环，影响下游辅助因子的(NADPH、NADH和ATP)的生成，进而影响L-苏氨酸合成。