[发明专利]一种突变体及其构建方法和应用

说明书

本发明提供了一种突变体，其氨基酸序列为如下(a)或(b)：(a)至少取代、缺失或添加天然的L‑赖氨酸氧化酶的氨基酸序列的一个氨基酸，且与该序列具有90％以上同源性；或(b)至少取代、缺失或添加天然的L‑赖氨酸氧化酶的氨基酸序列的一个氨基酸，且与该序列具有相同的功能。本发明提供的L‑赖氨酸氧化酶突变体与野生型L‑赖氨酸氧化酶相比，突变体热稳定性更好。通过本发明所提供的构建方法得到的L‑赖氨酸氧化酶突变体热稳定性更好，在较高的温度下氧化L‑赖氨酸时，仍然表现出优良的的催化活性，在L‑赖氨酸生物传感器检测及生物化工等领域具有较高的应用潜力。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种突变体及其构建方法和应用。

背景技术

L-赖氨酸又称为第一限制性氨基酸，它不仅能调节体内代谢平衡，而且对提高体内对谷类蛋白质的吸收，改善人类膳食营养，促进生长发育都有着重要作用。因此，L-赖氨酸含量是一种作为检测的重要的指标。传统的物理、化学检测方法检测时间长、成本高、操作过程繁琐，而生物催化是一种高效简单的方法。L-氨基酸氧化酶是一类生物体内参与氨基酸氧化代谢的重要氧化还原酶，大部分是黄素蛋白，能够以氧分子为电子受体催化L-氨基酸氧化脱氨，生成相应的酮酸、氨(NH3)和过氧化氢(H2O2)。目前发现的大部分L-氨基酸氧化酶都有较宽广的底物谱，在催化氧化某一种氨基酸时，往往会受到其他存在的氨基酸的干扰。有些L-氨基酸氧化酶能够专一性识别特定氨基酸，而不受其他种类氨基酸的干扰。L-赖氨酸氧化酶能够与L-赖氨酸发生特异的催化反应，是生命活动的重要催化剂，且催化反应条件温和、产物单一、耗能小、产物易分离，在食品、化工、环保、能源以及医药领域都有着广泛地应用。然而，由于天然L-赖氨酸氧化酶在高温、极端酸碱度、有机溶剂、非天然底物、产物抑制等苛刻条件下，稳定性及催化活性将大大降低，难以满足工业生产方面的应用需求。

蛋白质工程是以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过化学、物理和分子生物学的手段进行基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造或制造一种新的蛋白质以满足人类对生产和生活的需求。理性设计是蛋白质工程改造中最常用的方法，利用计算机辅助分子模型结合定点突变，以实现蛋白质功能优化，如提高催化活性、热稳定性、耐酸碱性等。为了有效优化蛋白质的热稳定性，Markus Wyss等人于2001 年提出Consensus Concept理论。和常规蛋白质理性设计方法基于蛋白质精确结构-功能关系不同的是，Consensus Concept理论是基于同源蛋白的氨基酸序列信息，从进化的角度分析能提高酶热稳定性的信息。本发明以 Consensus Concept理论为指导思想，对L-氨基酸氧化酶家族序列进行整合分析，并结合生物信息学辅助，获得具高稳定性的新型L-赖氨酸氧化酶突变体。相关研究目前未见报道。

发明内容

因此，本发明的目的是针对现有的L-赖氨酸氧化酶突变体的热稳定性不足的问题，提供一种具有热稳定性的突变体、扩增该L-赖氨酸氧化酶突变体突变位点核酸序列的引物对以及包含该突变体的种可溶性蛋白、酶制剂、重组细胞、重组载体，用于催化氧化L-赖氨酸。

根据本公开的第一方面，提供了一种突变体，其氨基酸序列为如下(a) 或(b)：

(a)至少取代、缺失或添加天然的L-赖氨酸氧化酶的氨基酸序列SEQ ID NO.1的一个氨基酸，且所述突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO.1具有 90％以上同源性；或

(b)至少取代、缺失或添加天然的L-赖氨酸氧化酶的氨基酸序列SEQ ID NO.1的一个氨基酸，且所述突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO.1具有相同的功能。

在一些可能的实现方式中，突变体的氨基酸序列被配置为包括SEQ ID NO.1上的突变位点T122V、D229N、A417V、G438D中的一个或多个突变的氨基酸序列。

在一些可能的实现方式中，突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO.2～16 中的任一种。