[发明专利]miRNA 408在调控作物镉积累中的应用

说明书

本发明公开了miRNA 408在调控作物镉积累中的应用，属于生物技术领域。本发明构建了MIR408前体基因过表达载体，转化受体水稻获得的MIR408功能获得的转基因水稻，一方面可显著抑制稻米的镉含量积累，另一方面对其他农艺性状无根本性影响，因而可以为培育低镉水稻提供重要遗传材料，也可用于其他单子叶作物的遗传转化，为种植在镉污染土壤中的其他作物降低镉积累等重金属危害提供参考。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及小分子RNAmiR408在低镉作物培育中的应用。

背景技术

“国以民为本，民以食为天”。水稻是重要的粮食作物，全球有一半以上人口以稻米作为主食。如何让人们吃到更加优质、更加安全的稻米，是当今水稻育种工作的重要目标。镉(Cadmium，Cd)是人体非必需元素，长期食用遭到Cd污染的食品，会引起慢性中毒。水稻是对Cd吸收最强的谷类作物，除Cd以外，我国耕地面积约20％还受到砷、铅等重金属污染。因而，水稻等作物可食用部位的重金属含量是否超标已成为当今人们生产、生活的重要社会问题之一。

目前，参与水稻Cd吸收、转运与积累的相关基因报道较少。利用水稻抗镉和镉敏感材料构建作图群体，发现OsHMA3，编码heavy-metal ATPase(P1B)家族转运蛋白，可将Cd固定到根细胞液泡中，从而降低Cd从根系运输到茎、叶、籽粒等地上部分；OsNRAMP5是水稻锰(Manganese，Mn)和Cd元素的共转运蛋白，虽然沉默OsNRAMP5基因表达的水稻植株可以显著降低植株Cd积累，但同时也会阻碍水稻Mn元素吸收，进而影响水稻生长发育和降低产量；低亲和阳离子转运蛋白OsLCT1在水稻Cd转运过程中发挥了重要作用，其在水稻叶片和茎中维管束中大量表达，沉默OsLCT1基因表达的转基因植株不影响木质部Cd转运，但显著影响韧皮部Cd的转运，因此可有效降低稻米Cd的积累含量，由于其他农艺性状和金属离子代谢并未发现受到OsLCT1的调控，因此该基因被认为可用于低镉水稻育种工作。

MicroRNA(miRNA)是植物体内一类重要的小分子RNA，在植物生长发育、抵御外界生物和非生物胁迫等过程中均扮演了重要角色。miR408是一类植物保守的miRNA，由MIR408前体基因加工而成。研究表明，不同植物成熟miR408的序列高度相似，由于5’端并不是尿嘧啶(Uracil，U)，因而miR408被选择进入AGO2而非AGO1 RISCs。植物miR408的靶基因同样相当保守，均编码Blue Copper家族蛋白。不同植物中miR408调控Blue Copper家族Laccase、Phytocyanin和Plastocyanin亚家族蛋白的不同成员。尽管植物miR408被报道可以参与低温、盐渍等氧化胁迫的响应过程，但其是否介导Cd等重金属的吸收、转运和积累过程的生物学功能还未知，是否可用于低镉水稻育种尚不清楚。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可调控作物镉含量的小分子RNA，将其应用到低镉作物的育种当中。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明通过检测水稻在重金属镉胁迫处理条件下的miRNA前体表达水平，发现miRNA(miR)408被大量诱导；构建了miR408过量表达和CRISPR-cas9的表达载体，转化水稻后获得了miR408过表达和基因敲除的水稻材料；对种植于镉污染土壤中的以上材料的糙米镉含量测定发现，miR408过表达水稻糙米镉含量显著下降，miR408敲除株系水稻糙米镉含量显著上升，说明miR408在调控水稻糙米镉含量过程中发挥了重要作用。过表达miR408水稻植株在大田中种植表现的农艺性状(如植株高度、分蘖数、穗长、枝梗数)与对照无显著差异。

因此，本发明提供了核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的miRNA 408在调控作物镉积累中的应用。

所述应用包括：利用过表达技术在作物中过量表达miRNA 408，进而获得种子中镉低积累的转基因植株。