[发明专利]一种EqHV NS3蛋白的原核表达方法及应用

权利要求书

1.一种EqHV NS3蛋白的原核表达方法在用于制备EqHV NS3蛋白的多克隆抗体中的应用，其特征在于，包括以下步骤：

（1）EqHV NS3蛋白的原核表达方法：

1）根据EqHV毒株的NS3基因设计引物Sac I 1893F和Bam I 1893R，以GD18毒株的反转录产物作为模板进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；所述引物的核苷酸序列如下所示：

上游引物Sac I 1893F：

5’ATCGAGCTC GATGTCACCTATTACAGCCACTGTCACT 3’ （SEQ ID NO：1）；

下游引物Bam I 1893R：

5’CGCGGATCCCTATCATTAATGGTGATGGTGATGATGATGGTGATGGTGATGATGATGGTGATGGTGATGATGCGTTTGGGTGTCAATCTCGGCCTCCAT 3’ （SEQ ID NO：2）；

2）用限制性内切酶Sac I 和Bam I 对PCR扩增产物和表达载体pMAL-c5x进行双酶切；

3）将酶切后的PCR扩增产物和表达载体pMAL-c5x进行连接，得连接产物；

4）将连接产物转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选获得阳性菌，提取质粒获得重组表达载体pMAL-c5x-NS3；

5）将重组表达载体pMAL-c5x-NS3转化入表达菌感受态细胞Rosetta（DE3），得到含有重组表达载体pMAL-c5x-NS3的重组表达菌；

6）将重组表达菌接入氨苄LB培养基中并加入诱导剂IPTG进行诱导表达；

7）取诱导后的菌液离心，加入结合缓冲液，超声破碎后离心，取上清液；

8）将上清液加入镍柱中洗脱获得纯化后的重组NS3蛋白；

（2）EqHV NS3蛋白的多克隆抗体制备：

①将步骤8）中所得纯化后的重组NS3蛋白与Gel 01 ST水溶性佐剂按比例溶解后皮下注射新西兰大白兔进行首次免疫；

②将步骤8）中所得纯化后的重组NS3蛋白与弗氏不完全佐剂按比例乳化，于首次免疫后的第7d、14d、28d、35d皮下注射新西兰大白兔进行加强免疫；

③免疫完成后于兔耳缘静脉采血分离血清，测定EqHV多克隆抗体效价和特异性；

④实验结果符合预期后，于免疫兔心脏采血获得含有EqHV多克隆抗体的血清并纯化。

2.根据权利要求1所述的一种EqHV NS3蛋白的原核表达方法在用于制备EqHV NS3蛋白的多克隆抗体中的应用，其特征在于，步骤6）中所述诱导表达的诱导温度为37℃。

3.根据权利要求1所述的一种EqHV NS3蛋白的原核表达方法在用于制备EqHV NS3蛋白的多克隆抗体中的应用，其特征在于，步骤6）中所述诱导表达的诱导时间为6h。