[发明专利]一种猪群体内腺病毒3型中和抗体阳性率的ELISA试剂盒及其检测方法

说明书

本发明创造提供了一种猪群体内腺病毒3型中和抗体阳性率的ELISA试剂盒及其检测方法，试剂盒中的包被抗原为重组蛋白SUMO3‑Hexon‑HVR_1‑6。本发明创造所述的ELISA检测方法对临床常见的几种猪病毒阳性血清进行检测，并无交叉反应；当血清样品稀释到1:320时仍能检测出阳性血清；批内重复的变异系数为1.0％～3.9％之间，批间重复变异系数在0.5％～8.3％之间；本间接ELISA检测方法与PCR核酸检测的阳性符合率为88％。

技术领域

本发明创造属于生物检测技术领域，尤其是涉及猪群体内腺病毒 3型中和抗体阳性率的ELISA试剂盒及其检测方法。

背景技术

猪腺病毒3型(porcine adenovirus serotype 3,PADV-3)属于腺病毒科，哺乳动物腺病毒属。动物感染腺病毒之后会出现水样腹泻症状，有可能会出现呼吸道症状或者神经症状，但是症状比较轻微[1]。而且经常与其他可以引起猪群腹泻的病毒混合感染[2-4]。所以在猪群中出现腹泻病猪时，大家往往会把病因归结于这些常见的引起猪腹泻的病毒上，从而忽视了PADV-3在其中扮演的重要角色。腺病毒有非常严格的宿主选择性，猪是猪腺病毒的唯一宿主，不感染其他动物[5]。

PADV-3是一个无囊膜的DNA双链病毒，。病毒外形是一个十二面体，病毒衣壳主要由252个蛋白衣壳粒子，其中有240个六邻体 (Hexon)，12个五邻体蛋白(penton)[6-7]。腺病毒的中和抗体IgG 主要是识别腺病毒的衣壳蛋白[8]，腺病毒的主要中和表位都集中在Hexon的高变区(hypervariable region,HVR),其次是penton蛋白和 fiber蛋白[9-10]。每个Hexon都是有三个Hexon分子形成的聚合体分子，这个三聚体由一个五面体的基底和三角形的塔尖构成，基底部分是P1和P2两个结构域。顶部塔区部分由四个环组成，Loop₁、Loop₂、Loop₃、Loop₄[11]。根据相关报道发现，Hexon的P1区和P2区是非常保守的，不同血清型的HVRs的氨基酸的变化主要集中在Loop₁和 Loop₂上[12]。这两个环上包含了7个超变区HVR₁、HVR₂、HVR₃、 HVR₄、HVR₅、HVR₆、HVR₇，其中HVR_1-6是在比较复杂的Loop₁区域上，HVR₇在Loop₂区域。这些超变区的长度根据病毒血清型的不同有所变化。其中HVR₁、HVR₂、HVR₄、HVR₅、HVR₇包含了大量中和抗原决定簇，这五个高变区涵盖了Hexon蛋白约99％的型特异性氨基酸残基[13]。所以Hexon常被作为PADV-3检测的主要关注点。

目前已有学者尝试将Hexon基因全长在原核系统中进行了表达 [14]，但是可能与培养的条件或者基因中包含大量的稀有密码子有关系，导致表达的蛋白都是以包涵体的形式存在。另外，现在关于 PADV-3的检测方法主要有普通的PCR和荧光定量PCR方法，血清学方面的相关研究比较少[15]。

发明内容

为了方便有效的检测猪群中PADV-3的中和抗体的阳性率，本发明通过将原核表达的重组Hexon蛋白作为包被抗原建立了间接 ELISA检测方法，并对该方法的敏感性和特异性进行了评价。提供了一种使用有效的检测猪群PADV-3中和抗体阳性率的方法，PADV-3 作为一种优良的疫苗载体被广泛应用[16]，但是动物体内预存的中和抗体却会对此载体疫苗的效果造成较大的影响，所以了解猪群体内 PADV-3中和抗体的阳性率可以为PADV-3载体疫苗的开发提供材料。