[发明专利]荧光探针检测尿嘧啶-DNA糖基化酶活性的方法

说明书

本发明公开了一种荧光探针检测尿嘧啶‑DNA糖基化酶活性的方法为在实时聚合酶链式反应仪中混合聚合酶链式反应缓冲液、一个基于荧光共振能量转移的荧光DNA探针、尿嘧啶‑DNA‑糖基化酶，将反应液在25℃‑37℃培养30分钟，而后在95℃加热2分钟，最后在25℃‑37℃培养10分钟，在聚合酶链式反应仪的荧光测量通道为波长520 nm处收集嘧啶‑DNA糖基化酶活性数据；所述的基于荧光共振能量转移的荧光DNA探针为FAM‑GCCAACCdUGGCTCT‑BHQ1，其中,FAM为荧光报告基团，BHQ1为荧光淬灭基团；所述的聚合酶链式反应缓冲液成份为Tris‑HCl、KCl、MgCl2。具有简单高效的技术优点。

技术领域

本发明涉及一种荧光探针检测尿嘧啶-DNA糖基化酶活性的方法。

背景技术

尿嘧啶-DNA-糖基化酶是碱基切除修复过程中的关键酶，可通过错配核酸标记荧光染料或胞嘧啶脱氨作用去除引入DNA中的尿嘧啶残基。尿嘧啶-DNA-糖基化酶水解单链或双链DNA中的尿嘧啶糖苷键，切除尿嘧啶并在DNA链中产生无碱基位点。可通过核酸内切酶，加热或碱处理水解这些无碱基位点。由于其特性，在聚合酶链式反应（聚合酶链式反应）中，尿嘧啶-DNA-糖基化酶作为防止残留污染的首选酶。迄今为止，大多数测量尿嘧啶-DNA-糖基化酶活性的方法都是使用放射性同位素标记化合物，不适合一般聚合酶链式反应实验室建立良好的质量控制。

但是，主要的关注点是建立良好的质量控制（QC），以便由聚合酶链式反应试剂盒生产公司正确评估尿嘧啶-DNA-糖基化酶酶的活性。

许多商用尿嘧啶-DNA-糖基化酶酶提供了不同的方法来评估其活性如下表：

Sigma	NEB	Thermo
一个单位定义为在37℃下在60分钟内完全降解1μg纯化的含单链尿嘧啶DNA（噬菌体M13，在E.coli CJ 236 dut-尿嘧啶-DNA-糖基化酶-中生长）所需的尿嘧啶DNA糖基化酶的量	4-105 cpm /µg）的50 µl反应中释放[3H]-尿嘧啶来测定活性。]]>	1个单位的酶催化在37℃下60分钟内从含尿嘧啶的DNA模板中释放1纳摩尔的尿嘧啶

它们不仅在评估方法上不同，而且在测量灵敏度上也不同。不同的评估方法导致活性评估产生不确定性。因此，我们决定根据简单性，敏感性和可及性的原则，开发一种通用的评估尿嘧啶-DNA-糖基化酶活性的方案，该方案可用于任何聚合酶链式反应实验室。我们已经设计了尿嘧啶-DNA-糖基化酶特定的FRET探针，并制定了使用常规实时聚合酶链式反应设备测试尿嘧啶-DNA-糖基化酶活性的简单方案。

传统的尿嘧啶-DNA-糖基化酶检测方法需要复杂的放射性标记，耗时的电泳或表面分离。