[发明专利]一种抗猪流行性腹泻病毒的单链抗体及制备方法

说明书

本发明公开了一种小鼠来源的抗猪流行性腹泻病毒(PEDV)的单链抗体及其制备方法。使用小鼠来源的抗PEDV单克隆杂交瘤细胞，扩增IgG抗体的重链可变区和重链可变区序列，经linker相连，克隆进原核表达载体pET‑32a，单链抗体的氨基酸序列如所示SEQ ID No.2所示。经IPTG诱导表达、亲和层析纯化得到的单链抗体分子量约为29kDa，ELISA显示单链抗体可特异性识别PEDV，假病毒中和试验显示单链抗体可在细胞水平上中和PEDV假病毒感染PK15细胞的能力。抗PEDV单链抗体有望中和PEDV在仔猪体内的感染活性，阻断病毒在仔猪群中的传染。

技术领域

本发明属于抗体工程的技术领域，具体涉及一种小鼠来源的抗猪流行性腹泻病毒的单链抗体及制备方法。

背景技术

猪流行性腹泻病毒（PEDV）属于冠状病毒科冠状病毒属。不同年龄段和品种的猪感染PEDV可引起急性传染性疾病，主要临床症状为水样腹泻、呕吐和脱水，2周龄以内的仔猪感染PEDV极容易引起脱水死亡，死亡率高达100%。1952年，Doyle等确定了病原体PEDV，随后在世界各地陆陆续续发现了该病毒，现已成为世界性的猪急性传染病。近年来，PEDV在我国有进一步流行的趋势，尤其是冬季和早春寒冷季节常呈地方性暴发流行，给生猪养殖业带来极大损失，一定程度上推高了猪肉价格，影响到了民众的生活成本。PEDV在猪呼吸道、十二指肠、回肠和空肠中均可检测到，可经粪便和鼻腔分泌物排出并传染，猪感染PEDV后免疫力显著下降，对其它细菌性感染的抵抗力显著减弱。目前该病毒感染的主要预防手段是接种疫苗，包括灭活疫苗和减毒活疫苗。妊娠母猪经口、鼻、肌肉和乳腺内接种疫苗可产生乳汁免疫，我国哈尔滨兽医研究所研制的PEDV和猪流行性腹泻的二联细胞培养灭活疫苗具有一定免疫效果，但仍不能百分比保护仔猪不被PEDV感染致病或致死。

现有预防手段主要是针对母猪进行疫苗接种，而无法直接刺激仔猪的免疫系统，由于仔猪的免疫系统未发育完全，不能产生针对PEDV的主动免疫，因此直接给仔猪提供抗体等被动免疫措施尤为重要。例如专利公开的抗PEDV的单链抗体及其制备方法，采集抗PEDV血清抗体阳性的仔猪白细胞，获得抗体重链可变区和轻链可变区序列。但是通过猪源抗体获得序列存在下列缺陷：仔猪感染PEDV后死亡率接近100%，很少有存活仔猪产生抗体；从仔猪血液中分离白细胞获得抗体序列，无法鉴定对PEDV具有高亲和力和特异性的抗体。

单链抗体是利用基因工程的办法将抗体的重链可变区和轻链可变区通过一个多肽linker相连，能够特异性结合病毒并中和病毒感染性，单链抗体的分子量较小、穿透能力强于完整抗体，且来源于单克隆抗体的单链抗体具有高亲和力和特异性的特点，在仔猪体内能够中和病毒，适用于给仔猪提供即刻被动免疫，保护仔猪不被病毒感染致病。

发明内容

本发明的目的是提供一种小鼠来源的抗PEDV单链抗体，单链抗体可特异性识别PEDV，从而有望中和PEDV的感染活性，阻断PEDV在仔猪群中的传染，同时还提供了一种利用大肠埃希菌原核表达可溶性抗PEDV单链抗体的制备方法。

本发明解决上述技术问题采用的技术方案为：

一种小鼠来源的抗猪流行性腹泻病毒的单链抗体，所述单链抗体具有如SEQ IDNo.1所示的核酸序列以及如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；所述单链抗体具有如SEQ IDNo.3所示抗体重链可变区的氨基酸序列，如SEQ ID No.4所示抗体轻链可变区的氨基酸序列，以及位于重链可变区和轻链可变区之间的linker氨基酸序列。

SEQ ID No.1 核酸序列展示如下