[发明专利]一种降低脱靶效应的RNA基因编辑系统的制备方法

权利要求书

1.一种融合蛋白，其特征在于，自N端至C端依次包括Cas13b蛋白的氨基酸序列、ADAR2蛋白的氨基酸序列和具有二氢叶酸还原酶活性的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，编码具有二氢叶酸还原酶活性的氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1中第6149位-6619位。

3.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于，还包括报告基团蛋白氨基酸序列；

可选的，所述融合蛋白，自N端至C端依次包括Cas13b蛋白的氨基酸序列、ADAR2蛋白的氨基酸序列、报告基团蛋白氨基酸序列和具有二氢叶酸还原酶活性的氨基酸序列；

可选的，所述报告基团蛋白为mCherry蛋白；

可选的，所述融合蛋白还包括NES氨基酸序列；

可选的，所述融合蛋白，自N端至C端依次包括Cas13b蛋白的氨基酸序列、NES氨基酸序列、ADAR2蛋白的氨基酸序列、报告基团蛋白氨基酸序列和具有二氢叶酸还原酶活性的氨基酸序列。

4.生物材料，其特征在于，包括如下任意一种：

1)编码权利要求1-3任一项所述的融合蛋白的核酸分子；可选的，所述核酸分子为DNA或RNA；可选的，所述DNA包括DNA分子、cDNA、基因组DNA或重组DNA；可选的，所述RNA为mRNA或hnRNA；可选的，如SEQ ID NO.1所示的第926位-6619位的DNA分子或cDNA；

2)表达权利要求1-3任一项所述的融合蛋白的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系；

3)含1)所述的核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系；

4)含2)或3)中所述的表达盒的重组载体、重组微生物或转基因细胞系；

5)含2)或3)或4)中所述的重组载体的重组微生物或转基因细胞系。

5.权利要求1-3任一项所述的融合蛋白或权利要求4所述的生物材料在基因编辑或制备基因编辑工具中的用途；

可选的，所述基因编辑为RNA基因编辑；

可选的，在提高RNA基因编辑安全性中的用途；

可选的，在降低RNA基因编辑中脱靶效应的用途；

可选的，所述RNA基因编辑为RNA单碱基基因编辑；

可选的，所述RNA基因编辑为真核生物RNA单碱基基因编辑；

可选的，所述真核生物包括真核细胞。

6.一种RNA基因编辑系统，其特征在于，包括权利要求1-3任一项所述的融合蛋白；

可选的，所述RNA基因编辑系统为表达权利要求1-3任一项所述的融合蛋白的重组载体、重组微生物或转基因细胞系；

可选的，还包括sgRNA；

可选的，还包括sgRNA的表达载体。

7.一种如权利要求6所述的RNA基因编辑系统的制备方法，其特征在于，包括：

编码具有二氢叶酸还原酶活性的氨基酸序列的核苷酸序列记为ecDHFR DD核酸序列；将ecDHFR DD核酸序列构建到含有RNA基因编辑系统表达元件dRanCas13b与hADAR2的表达载体中，且ecDHFR DD核酸序列与表达元件dRanCas13b与hADAR2位于同一表达盒内，所述ecDHFR DD核酸序列位于hADAR2的C端，构建得到的表达载体记为ecRESCUE表达载体。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述含有RNA基因编辑系统表达元件dRanCas13b与hADAR2的表达载体为RESCUE RNA编辑系统的表达载体；

可选的，所述的RESCUE RNA编辑系统的表达载体为真核表达载体；

可选的，所述含有dRanCas13b与hADAR2表达元件的表达载体为在dRanCas13b的C端连有NES序列的载体；

可选的，所述NES序列的C端连有报告基团的核酸序列；

可选的，报告基团的核酸序列为mCherry的核酸序列；

可选的，报告基团的核酸序列的C端连有ecDHFR DD核酸序列。