[发明专利]用于筛选影响胶原稳定性化合物的高通量筛选方法

权利要求书

1.一种用于筛选影响胶原稳定性化合物的高通量筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：构建去掉信号肽的人I型胶原α1与mVenus融合表达质粒mVenus-Col1A1、去掉信号肽的人I型胶原α2与mApple融合表达质粒mApple-Col1A2，去掉信号肽的人III型胶原α1与mVenus融合表达质粒mVenus-Col3A1和去掉信号肽的人III型胶原α1与mApple融合表达质粒mApple-Col3A1，经转化DH5α菌和质粒提取步骤得到用于转染的质粒；

步骤2：利用成纤维细胞共转染mVenus-Col1A1和mApple-Col1A2，或mVenus-Col3A1和mApple-Col3A1，质粒共转染细胞后12h，加入浓度为0.01—500μM的P4HA1抑制剂s4682；

步骤3：用药干预24—48h后酶标仪检测FRET，根据测得的能量转移效率得到抑制剂s4682抑制胶原链分子间相互作用的IC50。

2.根据权利要求1所述的用于筛选影响胶原稳定性化合物的高通量筛选方法，其特征在于，在步骤3中，检测FRET的具体步骤为500—515nm激发，检测525—545nm和580—620nm荧光强度FI₅₃₀和FI₅₉₀。

3.一种用于筛选影响胶原稳定性化合物的高通量筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：构建去掉信号肽的人I型胶原α1与mVenus-N端(2-173aa)片段的融合表达质粒VN-Col1A1，去掉信号肽的人I型胶原α2与mVenus-C端(156-239aa)片段的融合表达质粒VC-Col1A2；去掉信号肽的人III型胶原α1与mVenus-N端片段融合表达质粒mVN-Col3A1和去掉信号肽的人III型胶原α1与mVenus-C端片段融合表达质粒mVC-Col3A1，经转化DH5α菌和质粒提取步骤得到用于转染的质粒；

步骤2：利用成纤维细胞共转染VN-Col1A1和VC-Col1A2，或VN-Col3A1和VC-Col3A1，质粒共转染细胞后12h，加入浓度为0.01—500μM的P4HA1抑制剂s4682；

步骤3：用药干预24—48h后酶标仪检测Venus荧光，根据测得的Venus相对荧光强度得到抑制剂s4682抑制胶原链分子间相互作用的IC50。

4.根据权利要求1所述的用于筛选影响胶原稳定性化合物的高通量筛选方法，其特征在于，在步骤3中，检测Venus荧光采用的激发波长为510—520nm，发射波长为528—560nm。

5.一种用于筛选影响胶原稳定性化合物的高通量筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：构建去掉信号肽的人I型胶原α1与Gluc-N端(2～416aa)片段的融合表达质粒GlucN-Col1A1，去掉信号肽的人I型胶原α2与Gluc-C端(398～550aa)片段的融合表达质粒GlucC-Col1A2；去掉信号肽的人III型胶原α1与Gluc-N端片段融合表达质粒GlucN-Col3A1和去掉信号肽的人III型胶原α1与Gluc-C端片段融合表达质粒GlucC-Col3A1，经转化DH5α菌和质粒提取步骤得到用于转染的质粒；

步骤2：利用成纤维细胞共转染GlucN-Col1A1和GlucC-Col1A2，或GlucN-Col3A1和GlucC-Col3A1，质粒共转染细胞后12h，加入浓度为0.01—500μM的P4HA1抑制剂s4682；

步骤3：用药干预24—48h后加入荧光素酶底物，用酶标仪检测Gluc化学发光，根据测得的相对化学发光强度得到抑制剂s4682抑制胶原链分子间相互作用的IC50。

6.一种利用如权利要求1至5任一项所述用于筛选影响胶原稳定性化合物的高通量筛选方法在测定降低胶原三股螺旋稳定性药物的药效定量分析中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述降低胶原三股螺旋稳定性的药物用于治疗胶原增生疾病，包括器官纤维化、瘢痕。