[发明专利]一种生产重组蛋白酶K的方法

权利要求书

1.蛋白酶K的重组表达载体，其特征在于，在pPICZαA载体质粒中插入了编码蛋白酶K的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的重组表达载体，其特征在于，所述蛋白酶K为林伯氏白色念球菌的蛋白酶K；

优选地，所述编码蛋白酶K的核苷酸序列经过密码子优化；

优选地，所述编码蛋白酶K的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

3.根据权利要求1或2所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体中还插入了编码蛋白标签的核苷酸序列，所述蛋白标签优选为His标签。

4.具有权利要求1～3任意一项所述重组表达载体的宿主细胞；

优选地，所述宿主细胞为酵母，优选为毕赤酵母。

5.利用权利要求1～3任意一项所述重组表达载体或权利要求4所述宿主细胞生产重组蛋白酶K的方法。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将转入了所述重组表达载体的宿主细胞，涂布于博来霉素抗性的平板培养基上，培养过夜；

(2)挑取单菌落置于博来霉素抗性的液体培养基中培养，加入诱导剂诱导蛋白表达，得发酵液；

(3)对所述发酵液进行过滤，去除菌体，收集上清，纯化。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，发酵期间氨水控制pH值为4.5～5.5，溶氧维持在20％-35％之间；

和/或，发酵期间当溶氧回升至80％以上时开始补加甘油培养基，当菌浓达180-220g/L时，停止补加甘油培养基；

和/或，发酵期间当溶氧回升至100％时，饥饿半小时后，开始补加甲醇诱导培养基，诱导表达40～55小时后放罐。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述甘油培养基包含质量百分比为45～55％的甘油以及浓度为3.5～5ml/L的微量元素PTM1；

和/或，所述甲醇诱导培养基为包含3.5～5ml/L微量元素PTM1的甲醇溶液。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述过滤包括：先采用孔径小于1微米的滤膜过滤，再采用孔径小于25KDa的滤膜过滤。

10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述纯化包括将所述上清过亲和层析柱，优选为镍离子金属螯合亲和层析柱Ni²⁺-NTA；

优选地，所述纯化包括：将所述上清加入到所述亲和层析柱中，用含有70～90mM咪唑的缓冲液洗涤以去除杂蛋白,然后用含有400～600mM咪唑的缓冲液洗脱，得到含有目的蛋白的溶液。