[发明专利]一种重组蓝铜肽前体-寡肽的高纯度制备方法

说明书

本发明公开一种重组蓝铜肽前体‑寡肽的高纯度制备方法，涉及基因工程领域。该制备方法利用大肠杆菌合成重组多拷贝GHK串联短肽，及酶解法切割释放GHK单体以大量生产GHK单肽。该方法的关键在于(1)利用class‑IIS型限制性核酸内切酶在识别位点下游特定位置切割任意DNA序列的特点，实现短肽的多次串联延长；解决了基因工程表达短肽的低表达量的问题，具有降低生产成本、减轻化学合成中造成的环境负担的优势；(2)无需蛋白纯化柱，简单通过硫酸铵沉淀‑等电点沉淀结合的蛋白纯化方法，即可高效分离纯化酶切获得GHK单体；与GHK标准品具有相同的生物活性，且纯度高、成本低。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别涉及一种重组蓝铜肽前体-寡肽(GHK)的高纯度制备方法，具体是利用酶切串联多肽制备可用于医疗和护肤的GHK的工艺方法。

背景技术

蓝铜肽前体-寡肽(GHK)是一种由甘氨酸、赖氨酸和组氨酸三个氨基酸组成的三联体短肽，其在溶液中可以自发地和铜离子结合形成蓝铜胜肽。蓝铜胜肽(GHK-Cu)具有较高的社会价值和经济价值，应用于化妆品中，可以起到减少皱纹以及抗衰老的功效。

蓝铜胜肽(GHK-Cu)最初于1973年从人的血浆中分离得到。近年来有人报道，GHK和GHK-Cu可以在纤维原细胞培养液中促进或抑制金属蛋白酶的合成，还能促进多种细胞和组织的生长、分裂和分化。

接下来的几年中，人们陆续发现GHK-Cu的多种功能及应用，如：1)抗炎症活性，在最近的研究发现，GHK-Cu复合物可减少TNF-α依赖的IL-6在人类皮肤成纤维细胞中的分泌。由于其抗炎症性质，铜肽可取代类固醇或非固醇类抗炎症药物在皮肤炎症治疗中的作用。其还可以减少紫外线诱导的红斑；2)DNA修复，最近研究表明GHK-Cu具有恢复经辐射后的完整细胞的功能的能力，GHK-Cu可刺激经辐射后的成纤维细胞生长并促进其表达更多的生长因子bFGF和VGF；3)神经再生。2005年，Ahmed的研究表明GHK可促进神经再生。研究者使用带有合成GHK短肽的胶原管研究轴突再生，发现GHK使造血细胞至胶原管的迁移、神经生长因子的产量、整合素的表达以及有髓鞘的神经纤维再生速率增加，同时增加了轴突数量和神经鞘细胞的增殖；4)在干细胞中的效应。2009年，汉城国立大学的一组研究团队发现，铜肽GHK-Cu可刺激角质细胞的增殖以及整合素和p63蛋白的在表皮干细胞的表达。由于p63被认为是一种重要的干细胞标记物和抗衰老蛋白，作者总结GHK-Cu能够修复表皮干细胞，同时增强其修复表皮的能力。2012年，该研究团队报道称未结合Cu的GHK中也观察到该活性；5)抗癌症效应。2010年，Hong Y.团队揭示了GHK-Cu能够逆转某些与结肠癌的转移性扩散相关基因的表达，在非常低的浓度(1mM)即有极高效率；

此外，最近的基因组研究表明GHK直接调节基因表达，可能可以解释许多生物学现象的差异。Iorio研究团队探索产生相似转录应答的复合体网络，发现抑制GHK的同时，在268个基因中的mRNA产量增加。通过对患有慢性阻塞性肺病的吸烟者的肺的研究发现，GHK能够逆转肺气肿损伤的基因表达信号。与肺气肿严重程度相关的基因表达信号包括127个基因，涉及炎症和修复。研究者确定GHK下调了涉及肺损伤和炎症的基因，同时上调了涉及组织修复的基因。在从患有肺气肿的肺中获取的肺成纤维细胞中添加10摩尔GHK，恢复了其胶原蛋白重构能力及将其组装至特定组织纤维中的能力。

GHK作为生物活性多肽，广泛用于实验和临床等目的。其大部分通过化学合成方式生产，其小规模短肽生产成本极高，且发展主要受到反应副产物过多、环境不友好、产率过低、反应底物和试剂价格过高等缺点的制约。基因工程技术成功生产了许多种蛋白。目前，通过基因工程生产蛋白主要步骤为分离目的基因，构建表达载体，在大肠杆菌宿主中生产蛋白，是一种非常高效生产相对短肽分子量较大的蛋白的方法，但由于其低表达量，此方法几乎不应用于短肽生产。