[发明专利]一种磷脂酶D的异源表达重组质粒以及其构建方法

说明书

本发明涉及一种磷脂酶D的异源表达重组质粒，其构建方法包括步骤一，人工合成质粒pUC57‑STR_ORI，步骤二，人工合成质粒pUC57‑STR_PLD，步骤三，重组质粒的构建，最终得到包括Kasop*组成型强启动子，肉桂链霉菌的信号肽，链霉菌来源的磷脂酶D合成基因和ApmR抗性筛选基因的重组质粒。本发明中所得重组质粒能够在链霉菌中成功表达，启动子具有强启动作用，信号肽能够使引导新合成的蛋白质向分泌通路转移的效果良好，磷脂酶D合成基因段能够使得磷脂酶D成功表达。本发明中通过质粒合成方法合成基因的表达元件，进而形成完整的重组质粒，且质粒结构稳定，并且便于向链霉菌宿主内转移，并保证在链霉菌宿主内成功表达。

技术领域

本发明属于基因重组领域，涉及一种磷脂酶D的异源表达重组质粒以及其构建方法。

背景技术

磷脂酰丝氨酸作为具有广阔市场前景的物质，在自然界中存在量少，且提取困难；目前市场上的磷脂酰丝氨酸主要是德固赛(degussa)公司生产的“磷脂酰丝氨酸Leci-PS”(August 28，2003)，并且主要是由大豆中提取，产量较低、价格昂贵。

近年来，人们开始关注酶转化法制备磷脂酰丝氨酸，即通过磷脂酶D催化底物磷脂酰胆碱和L-丝氨酸合成。微生物来源的磷脂酰丝氨酸合成酶D(以下简称PLD)具有转磷脂酰的活力，能在水相环境中催化合成磷脂酰丝氨酸，反应条件温和、副产物少、产品得率高、质量好，将会成为未来工业化的主要生产方法。

但直接从环境中筛选的野生菌催化活性较低，PLD分泌量远低于工业生产标准，严重影响到PLD酶在合成磷脂酰丝氨酸产业化的应用。

那么为了获取高产量的PLD就希望通过基因工程手段进行基因构建和基因改造，以获取能异源表达PLD的菌株，而那么构建一种能够良好表达PLD的重组质粒就变得十分关键。

一般情况下，表达载体具备复制原件，如复制子，使基因能在异源宿主中持续复制；具备控制元件，如启动子和终止子，控制基因的起始和终止；有些还具备一些特殊的原件，如信号肽中的分泌肽，可调控最终的表达产物分泌到胞外便于生产。另外，表达载体一般会携带某种抗性基因或其他标记，用于实验过程中阳性克隆的筛选。

并且根据现有专利技术的公开，已有对枯草芽孢杆菌等菌种进行基因工程改造的研究，例如CN108795837A-一种高效表达磷脂酶D的枯草芽孢杆菌工程菌，其中公开了放线菌来源的内源性磷脂酶D在枯草芽孢杆菌中的高效表达，另有对链霉菌中抽提出的PLD目的基因，进行蛋白质改造的研究，例如CN111004787A-一种链霉菌磷脂酶D突变体、改造方法及其应用，其中公开通过蛋白质工程手段对野生型PLD进行改造的研究内容；那么根据前人研究方向和成果，希望得到一种磷脂酶D的异源表达重组质粒，以寻求更高效、更便捷的构建方法。

发明内容

本发明的目的在于借助基因工程手段进行基因改造，构建一种磷脂酶D的异源表达质粒，使得其能够在链霉菌中成功表达。

本发明采用的技术方案如下：

一种磷脂酶D的异源表达重组质粒，质粒表达原件包括Kasop*组成型强启动子，肉桂链霉菌的信号肽，链霉菌来源的磷脂酶D合成基因和ApmR抗性筛选基因。

其中所述Kasop*启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

其中所述肉桂链霉菌的信号肽核苷酸序列如如SEQ ID NO.2所示。

其中所述链霉菌来源的磷脂酶D合成基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

一种磷脂酶D的异源表达重组质粒的构建方法，具体步骤包括：

步骤一，人工合成质粒pUC57-STR_ORI，步骤二，人工合成质粒pUC57-STR_PLD，步骤三，以pOJ260质粒为载体，构建重组质粒。