[发明专利]一种使用DNA聚合酶突变株高效合成5’标记RNA的方法

说明书

本发明属于生物技术领域，公开了一种使用DNA聚合酶突变株高效合成5’标记RNA的方法。该方法包括：将含目标序列的单链DNA、聚合酶缓冲溶液、5’末端带修饰的DNA寡核苷酸链的引物混合均匀，升温进行去空间结构处理再降温退火，得到混合体系1；往混合体系1中加入核糖核苷酸，SFM4‑3聚合酶，混合均匀，得到转录体系，孵育，纯化分离RNA，得到目标序列的5’标记RNA。本发明提供的方法，利用定向改造获取的热稳定DNA聚合酶在合成RNA的时候直接实现对所有RNA产物5’末端的荧光素或生物素等标记，并且在实现标记的同时仍然保持RNA分子的活性与功能。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种使用DNA聚合酶突变株高效合成5’标记RNA的方法。

背景技术

在核酸分子的研究和应用中，单链RNA末端标记是一项很重要的技术。单链RNA末端标记是将标记物(如荧光素、生物素等)通过一定的方式连接到RNA的5’末端或者RNA的3’末端，通过检查标记物，进而实现对RNA鉴别、检测，或对功能核酸(如RNA适配体)进行亲和力测定和应用开发。

单链RNA末端标记主要分为化学标记和酶法标记。化学标记难度大，成本高，而酶法标记比化学标记简单方便。单链RNA的5’末端标记和3’末端标记的方法各不相同。单链RNA的3’末端标记技术主要通过TdT法和T4 RNA连接酶法在RNA 3’末端增加一个修饰的核苷酸或者带修饰的小核酸片段。单链RNA的5’末端标记技术比较复杂，一般是先利用T4多聚核苷酸激酶对RNA的5’末端进行磷酸化，然后在T4 RNA连接酶的作用下，与一条通过化学修饰的寡核苷酸链连接。由于T4 RNA连接酶将带修饰的DNA片段连接到磷酸化的RNA 5’或3’末端的反应效率都较低，难以保证所有目标RNA分子的完全标记，单链RNA5’末端标记又一直没有很好的技术，因此使用该方法进行RNA的5’末端标记仍然比较困难。

RNA适配体是指在没有互补链存在的情况下，自身经过卷曲和折叠，形成特定的三级结构，并对靶标分子具有高亲和力和高特异性的单链RNA分子。RNA适配体文库经指数富集的配体系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands by ExponentialEnrichment,SELEX)筛选后，需要通过亲和力表征确定是否成功筛选到RNA适配体，而RNA的末端标记是测定RNA适配体亲和力的重要技术工具。RNA适配体的末端标记要符合以下要求：1)不破坏适配体的结构；2)不影响适配体对靶标的亲和力；3)标记物灵敏度高。已报道的RNA适配体亲和力测定都是采用放射性标记，此方法具有一定的危险性，需要专门的实验条件和资源，无法普及。单链RNA的5’末端标记技术又难以满足需求，因此RNA适配体末端标记还没有简便、安全、高效的方法。

SFM4-3聚合酶是以Taq DNA聚合酶的催化结构域SF片段为进化起点，通过使用噬菌体展示系统经定向进化后具有转录活性的DNA聚合酶。经过改造的SFM4-3聚合酶能识别2’-F/2’-OMe修饰的核糖核苷酸，并且可以直接转录合成天然的RNA以及带修饰的非天然RNA链。与T7 RNA聚合酶转录RNA不同，SFM4-3聚合酶转录RNA时不需要启动子，而是以单链DNA为模板，从DNA引物的3’末端开始延伸，直到模板的5’末端结束。由于使用SFM4-3聚合酶突变株进行的RNA以及修饰RNA的转录具有这一特点，所以可以方便地通过DNA引物在转录产物的5’端快速地引入各种标记。同时，如果选取适当的DNA引物，5’端的标记以及DNA小片段也不会对RNA转录产物的活性与功能产生太大的影响。

发明内容

为了克服现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种使用DNA聚合酶突变株高效合成5’标记RNA的方法。

本发明的目的至少通过如下技术方案之一实现。

本发明提供了一种简便、高效的RNA5’末端加标记的方法。该方法以含目标序列的单链DNA为模板，以5’末端带修饰的DNA寡核苷酸链为引物(由15个胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸组成)，通过使用定向改造获取的SFM4-3聚合酶转录合成5’标记的目标RNA或糖环修饰/非天然RNA。