[发明专利]一种细胞流式分析干细胞细胞因子的方法

说明书

本发明公开了一种细胞流式分析干细胞细胞因子的方法，本发明提供了一种通过合适的培养以及刺激条件，真实的模拟造血干细胞应激造血的体内条件，并通过固定破膜流式分析技术，检测出准确的造血干细胞胞内的细胞因子表达情况的染色技术。本发明操作较为简便，对细胞悬液制备操作的要求较低，只需要熟练掌握细胞培养的技术并按照本技术设计的条件培养就能获得与体内感染真实情况相符的应激造血的造血干细胞。且不需要制备芯片等操作，成本较低。本发明通过化合物将会分泌出胞外的细胞因子滞留在细胞内，可以有效准确地测量细胞胞内及胞外的细胞因子表达情况。为进一步地深入探讨造血干前体细胞的细胞因子表达与分泌的调控机制奠定技术基础。

技术领域

本发明涉及流式细胞技术领域，具体地，涉及一种细胞流式分析干细胞细胞因子的方法。

背景技术

流式分析技术是一种功能强大的技术，在免疫学，分子生物学，细菌学，病毒学，肿瘤生物学和传染病监测中有广泛且深入的应用，可以高精度地研究细胞群体。流式分析技术能够同时分析单个细胞的多个参数，比如：细胞表面和细胞内分子的表达、鉴定并确定异质细胞群中的不同细胞类型、评估分离亚群的纯度以及分析细胞大小和容积等。

流式分析技术是一项可以通过对应的可见光散射和荧光参数快速分析包裹在缓冲盐溶液中流经单个或多个激光的单个细胞或颗粒的技术。通过可见光散射在前侧向角的测量指示细胞的相对大小与颗粒度。通过使细胞表达荧光蛋白(如：绿色荧光蛋白GFP)，或通过荧光耦联抗体(如：CD3-FITC)和荧光染料染色(如：碘化丙锭)，使样品细胞带上相应的荧光信息。

在进行检测的时候，将待测细胞染色后制成单细胞悬液。用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的鞘液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过激光检测区域，检测器会检测细胞或颗粒的散射光。前面的检测器检测前向散射光(FS)，放置在侧面的多个检测器检测侧向散射光(SS)，FS与细胞的大小相关，SS则与细胞颗粒度成比例。因此，通常可根据细胞大小和颗粒度差异区分细胞群。荧光检测器则检测被染色的细胞或颗粒发射的荧光。不同样品细胞上带有的荧光受到激发而发出不同的信号，被仪器检测，从而能得到所需信息。

由于在细胞内，蛋白的表达与分泌不是同样的机制，有些细胞因子表达但不分泌，有些细胞因子表达就会分泌。由于目前由于缺少检测造血干细胞胞内细胞因子的方法，严重阻碍了深入了解造血干细胞的细胞因子表达与分泌的调控机制。

虽然，微流体单细胞蛋白质组学分析能够在单细胞水平上同时检测造血干细胞中多达15种的分泌蛋白。这一技术需要用到一种单细胞条形码芯片，该芯片由1040微室组成，每个微室装载单个细胞，且每个微室装载着条形码，每条条纹涂着一种独特的抗体。通过这种装置，能在单细胞水平上同时检测细胞的十多种分泌蛋白的水平。

但是，微流体单细胞蛋白质组学技术通量仍然较低，通常一次只能检测几千个细胞；微流体单细胞蛋白质组学技术需要制备芯片成本较高；微流体单细胞蛋白质组学技术操作繁琐，对操作者技术有一定要求，同时也更为耗时。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供了一种细胞流式分析干细胞细胞因子的方法，以适用于检测造血干细胞与祖细胞(Hematopoietic stem andprogenitor cell，HSPC)。该方法基于流式分析技术，通过合适的活化刺激剂与培养条件以模拟细胞在体内的真实情况。该方法能够更大程度地在体外检测到细胞胞内的细胞因子的表达情况，为进一步地深入探讨造血前体细胞的细胞因子表达与分泌的调控机制奠定技术基础。

本发明的第一个目的提供一种用于细胞流式分析的活化刺激剂的组合物。

本发明的第二个目的提供一种用于细胞流式分析的活化刺激剂的组合物。

本发明的第二个目的提供一种细胞流式分析干细胞细胞因子的细胞培养方法。