[发明专利]红麻铅胁迫响应基因EST-SSR引物组及试剂盒

说明书

本发明公开了一种红麻铅胁迫响应基因EST‑SSR引物组及试剂盒。本发明提供22个红麻EST‑SSR标记的引物序列。本发明的22个EST‑SSR标记在138份红麻品种/品系中具有多态性，可以将红麻种质完全区分开，并将138份材料划分为3个群体，说明红麻种质抵抗铅胁迫能力存在着明显的分群，为筛选耐重金属铅胁迫红麻种质资源、耐重金属铅分子标记辅助育种提供了候选标记。

技术领域

本发明涉及EST-SSR标记，具体而言，是红麻铅胁迫响应基因EST-SSR引物组及试剂盒，属于生物技术领域。

背景技术

红麻是一种重要的韧皮纤维作物、麻纺原料，是绿色环保天然纤维制品的重要原材料之一。红麻可富集土壤中的重金属，对修复酸性土壤起到重要作用。红麻资源的研究还停留在植物学性状、农艺性状、品质性状的描述上，缺乏抗逆性状等在分子层面的研究。开发功能基因的分子标记，可加快耐重金属红麻材料的筛选进程，减少亲本选择的工作量和时间。

简单重复序列多态性(Simple sequence repeats,SSR)是继形态学标记、同工酶标记之后的第三代标记的代表技术之一。SSR和SNP标记是目前两种最主流的分子标记技术，与SNP标记的二等位、易于自动化高通量分析不同，SSR分子标记与SNP一样，属于共显性标记，但是其多态性远高于SNP，在遗传多样性评价、群体结构分析、亲缘关系鉴定和指纹图谱等领域有着广泛的应用。

目前红麻分子标记的研究和应用也已开展，主要应用于遗传多样性研究、遗传连锁图谱构建和重要农艺性状QTL定位，使用的分子标记技术为包括SRAP，RAPD，AFLP，ISSR和SSR。总体来说，红麻的分子标记数量仍然非常少，尤其是目前主流的分子标记技术SNP和SSR分子标记与其他作物相比落后许多。开发新的分子标记尤其是SSR和SNP分子标记有利于加快红麻遗传改良进程。

随着二代高通量测序成本的降低，转录组测序成为SSR分子标记开发的重要途径之一，这种开发SSR分子标记的策略，在红麻中也有报道。EST-SSR分子标记是外显子区的简单重复序列差异，会导致基因编码的蛋白氨基酸产生剧烈变异，例如氨基酸插入/缺失，移码突变或提前终止。因此，表达序列标签简单序列重复多态性(EST-SSR)分子标记可能会直接引起基因功能缺陷，如果其所在基因是控制重要农艺性状的基因，其基因外显子区的SSR序列变异可能导致基因功能缺失，从而引起性状的变异。基于此，使用EST-SSR标记应用于数量性状定位，可以加速QTL定位确定候选基因。

基于转录组的分子标记开发，根据转录组测序的实验目的和采样方式不同，比如不同生物、非生物胁迫，不同生长发育阶段，不同的组织器官等，所得到的表达基因及差异表达基因DEGs也有所不同。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供了一组红麻铅胁迫响应基因EST-SSR引物及试剂盒。从铅胁迫转录组测序拼接unigene序列中，开发EST-SSR分子标记，并分析了转录组中SSR的分布规律，包含SSR的基因潜在功能，选择蛋白功能互作网络(PPI)基因DEGs设计了57对新的EST-SSR标记。利用30个红麻品种/品系中进行多态性标记筛选，经过琼脂糖凝胶电泳和ABI3730xl毛细管电泳两轮筛选，最终得到了22对检出率高，多态性好的EST-SSR标记。这些红麻铅胁迫差异表达基因的EST序列尚未提交到NCBI数据库，是新的EST序列，开发得到的22个新EST-SSR标记也不同于已报道的红麻SSR标记。

一种红麻铅胁迫响应基因EST-SSR引物组，所述引物共有22对，具体如下：

第1对引物，其序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；

第2对引物，其序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示；

第3对引物，其序列如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示；

第4对引物，其序列如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示；