[发明专利]辣椒CMS恢复系筛选KASP标记引物及应用

说明书

本发明涉及辣椒CMS恢复系筛选KASP标记引物，包括两条长49bp的正向引物KS23A1和KS23A2，以及一条长21bp的反向引物KS23C。本发明的关键创新点是发掘了与辣椒CMS育性恢复相关的SNP，开发出一个可用于辣椒CMS恢复系筛选的KASP分子标记KS23。利用KS23筛选辣椒CMS恢复系，只需根据实例三中的扩增体系和扩增程序，对待测植株DNA只进行一次PCR扩增，操作简单，无需进行CAPS标记的酶切反应和InDel标记复杂耗时的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，直接通过荧光定量PCR仪中荧光检测到的基因分型值和分布图，直接筛选出恢复基因型G/G和恢复系，检测效率达69％以上。

技术领域

本发明属于植物生物工程技术领域，具体涉及辣椒CMS恢复系筛选KASP标记引物及应用。

背景技术

辣椒是重要的蔬菜作物，辣椒杂种优势明显，但辣椒杂交种子生产过程中需要人工去雄，费时费工，且纯度难以保证。利用雄性不育系，尤其是胞质雄性不育(CMS)“三系”配套法生产杂交种子，一方面不但可以省去人工去雄环节，省时省工，还能确保杂交种子纯度，另一方面还可以减少亲本流失风险，保护品种知识产权。

然而，由于CMS恢复系较少，大多数自交系不具有恢复能力，需要人工田间转育恢复系。常规的转育方法是利用转育父本与恢复源进行不断的回交，每回交一代需要与不育系测交一代进行恢复单株的鉴定，费时费工，成本高，周期长。而利用分子标记可以对恢复单株进行苗期筛选，则无需进行单株测交验证，能够高效、快速地筛选恢复株系，极大缩短转育周期。

现有技术存在的问题：目前，已有个别关于辣椒CMS育性恢复的分子标记，但这些标记存在的主要问题是通用性较差，对于不同遗传背景材料的选择效率较低。另一个主要问题是多少标记为CAPS标记，需要先进行PCR扩增，然后再进行酶切处理，最后再进行电泳检测，步骤较多，程序繁琐，且所需内切酶成本较高，导致检测成本上升。

发明内容

鉴于现有技术的不足，本发明提供了辣椒CMS恢复系筛选KASP标记引物及应用。为了达到上述目的，本发明采用了如下的技术方案：

1、辣椒CMS恢复系筛选KASP标记引物KS23，包括两条长49bp的正向引物KS23A1和KS23A2，以及一条长21bp的反向引物KS23C。KS23A1如序列表SEQ ID NO：1所示，KS23A2如序列表SEQ ID NO：2所示，KS23C如序列表SEQ ID NO：3所示。

2、辣椒CMS恢复系筛选KASP标记引物KS23获取方法，包括如下步骤：

(1)利用不育系8A与恢复系R1(8A和R1均由甘肃省农业科学院蔬菜研究所选育)杂交，获得杂种一代F₁，F₁代植株自交得F₂。

(2)对F₂群体进行育性鉴定，最后选取30株完全不育单株和30株完全可育单株，分别构建不育池SP和恢复池RP。

(3)分别提取不育池SP和恢复池RP花蕾RNA，委托百迈克生物科技公司(http://www.biomarker.com.cn/)利用Illumina HiSeq2500进行高通量测序，测序读长为PE125。

(4)利用转录组数据在线比对软件STAR分别对SP和RP测序reads与辣椒参考基因组(The Pepper Genome Database 2.0)进行比对，并通过GATK(版本：3.1-1，https://www.broadinstitute.org/gatk/index.php)，查找单SNP位点。