[发明专利]一种促进蛋白二聚体形成的拉链扣结构及其应用

说明书

本发明属于基因工程领域，涉及一种促进蛋白二聚体形成的拉链扣结构及其应用，该拉链扣可用于同种蛋白的二聚，异种蛋白的二聚，也可用于多肽成环，二聚多肽及多肽的延伸。一些实例可以得到接近天然构象的ESAT6‑CFP10二聚体，该二聚体具有更好的可溶性，对记忆性T细胞刺激效果要好于线性融合表达的ESAT6‑CFP10蛋白。发明人还发现，二聚体拉链扣可帮助形成更稳定的环型多肽，添加了二聚体扣的CCP多肽可以增加对类风湿关节炎病人血清中瓜氨酸化自身抗体的检出率。

技术领域

本发明涉及生物领域，特别具体涉及蛋白领域，特别涉及一种促进蛋白二聚体形成的拉链扣结构及其应用。

背景技术

蛋白二聚体是一种蛋白质四级结构。同源双聚体是由两个相同的蛋白分子组合而成(此过程称为同源二聚作用homodimerization)，而异源二聚体则是由两种不同的蛋白质所形成(称为异源二聚作用heterodimerization)。生物化学中的大部分双聚体都不是用共价键相连结的。例如，反转录酶为一种非共价键连接的异源二聚体酵素，是由两种不同的氨基酸链连结的。另一个例外为双聚体蛋白NEMO，由双硫键连结的双聚体。有些蛋白会包含特殊的区域，确保二聚作用(二聚区域)的形成。在细胞的生长，繁殖，信号传导中，蛋白的二聚对功能的实现有重要的作用。研究蛋白的二聚体对了解蛋白的功能，生产应用十分重要。设计蛋白质二聚体是一项挑战性十足的任务。

目前公布的设计蛋白二聚体的方法有半胱氨酸结设计，3个以上的成不对称的奇数的半胱氨酸残基，位于目标蛋白的C端(Sherilyn L，2001)，这种方法亲和力高，但蛋白不稳定，易多聚沉淀；Knob-in-hole设计，改造自抗体的Fc片段，在双特异性单抗开发中有应用(Elliot JM.2014)；亮氨酸拉链是出现在DNA结合蛋白质和其它蛋白质中的一种结构基元(motif)，即模体，这种蛋白上的亮氨酸总是有规律地每隔7个氨基酸就出现一次。蛋白质α-螺旋每绕一圈为3.6个氨基酸残基。这种一级结构形成α-螺旋时，亮氨酸必与螺旋轴平行而在外侧同一线上排布，每绕两圈出现一次，两组平行走向，带亮氨酸的α-螺旋形成的对称二聚体。其上的亮氨酸残基，侧链上R-基因的分支碳链，又刚好互相交错排列，故名氨酸拉链。这种结构融合蛋白部分太大，不适合作为二聚体的融合蛋白。二硫键常常用于蛋白的二聚体设计中，但它带来的问题常常超过了益处。很多蛋白本身就有半胱氨酸存在，这些半胱氨酸与蛋白的三维结构，功能发挥起着巨大的作用，在蛋白表达出来时，多余设计进去的二硫键会干扰重组蛋白的正确折叠，造成蛋白包涵体出现。特别的，多余的半胱氨酸还会造成多聚体的出现。

天然蛋白的三维结构十分复杂，除了离子键的相互作用，氢键，疏水氨基酸之间的相互作用力占主导地位。蛋白与蛋白之间的相互作用更多的需要天然三维结构的互补才能形成稳定的二聚体结构。这对重组蛋白二聚体的形成提出了更高的要求。

FLAG标签是是常用的用于检测蛋白表达的标签，也常常用于重组蛋白的纯化，其氨基酸序列为DYKDDDDK。His标签是指六个组氨酸残基组成的融合标签，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。当某一个标签的使用，一是能构成表位利于纯化和检测；二是构成独特的结构特征(结合配体)利于纯化。组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力，可用固定化金属螯合层析填料(IMAC)对带His标签的重组蛋白进行亲和分离纯化。其他常用的标签还有V5标签，GKPIPNPLLGLDST；S标签：KETAAAKFERQHMDS；Myc标签：EQKLISEEDL；HA标签：YPYDVPDYA；MBP标签等等。

一些基因5'端具有一段较短的RNA序列(约150-250bp)，这类RNA序列能折叠成类似于起始tRNA的结构，从而介导核糖体与RNA结合，起始蛋白质翻译，这段非翻译RNA被称为内部核糖体进入位点序列(Internal ribosome entry site,IRES)。在基因工程中，IRES序列常用于多基因表达。例如，在目的基因之后插入IRES序列，后面是选择标记基因，这样转录出来的mRNA就可以同时表达两种蛋白。