[发明专利]使用来自螟蛾属的转座酶将核酸构建体转座入真核基因组

说明书

本发明提供了用于异源基因的高表达的多核苷酸载体。一些载体还包含进一步改善表达的新型转座子和转座酶。进一步公开了可在基因转移系统中使用，以将核酸稳定地引入细胞DNA中的载体。基因转移系统可以用于例如基因表达、生物加工、基因治疗、插入诱变，或基因发现等方法中。

相关申请的交叉引用

本申请要求于2019年4月8日提交的美国临时申请号62/831,097、2019年7月12日提交的美国临时申请号62/873,342，以及2020年3月17日提交的美国临时申请号62/990,568号的优先权；出于所有目的通过引用将每一篇的全部内容整体并入本文。

对序列表的引用

本申请涉及名为546917SEQLST.TXT的txt文件中公开的序列，该文件创建于2020年4月6日，为2,392,133字节，通过引用并入。

发明领域

本发明的领域涉及用于对靶细胞的基因组进行稳定修饰的DNA载体的配置，以及非天然转座子和转座酶的用途。

背景技术

整合到细胞基因组中的多核苷酸上编码的基因的表达水平取决于多核苷酸内序列元件的构型。整合的效率及从而整合到每个基因组中的多核苷酸的拷贝数，以及发生整合的基因组基因座也影响在多核苷酸上编码的基因的表达水平。通常可以通过将多核苷酸置于转座子中来提高多核苷酸整合到靶细胞基因组中的效率。

转座子包含被转座酶识别的两个末端。转座酶作用于转座子，以将其从一个DNA分子中去除，然后整合到另一个DNA分子中。两个转座子末端之间的DNA与转座子末端一起通过转座酶转座。本文的“合成转座子”指的是异源DNA，该异源DNA侧接一对转座子末端，以使其被转座酶识别并转座。将合成转座子和相应的转座酶引入真核细胞的细胞核中可能导致转座子转座到细胞的基因组中。这些结果是有用的，因为它们提高了转化效率，并且因为它们可以提高整合的异源DNA的表达水平。因此，本领域需要高活性转座酶和转座子。

通过piggyBac类转座酶的转座是完全可逆的。转座子最初整合在受体DNA分子中的整合靶序列上，在此过程中，靶序列在转座子反向末端重复序列(ITR)的每个末端处复制。随后的转座去除了转座子并使受体DNA恢复其先前的序列，即同时去除靶序列复本和转座子。但是，这不足以从已经整合了转座子的基因组中除去转座子，因为转座子很有可能从第一整合靶序列中切除而转座到基因组中的第二整合靶序列中。另一方面，缺乏整合(或转座)功能的转座酶可以从第一靶序列中切除转座子，但不能整合到第二靶序列中。因此，整合缺陷转座酶可用于逆转转座子的基因组整合。

转座酶的一种应用是用于工程真核基因组。这种工程可能需要将一个以上的不同多核苷酸整合到基因组中。这些整合可以是同时的或顺序的。当通过第一转座酶将包含第一异源多核苷酸的第一转座子转座入基因组之后是通过第二转座酶将包含第二异源多核苷酸的第二转座子转座入同一基因组时，有利的是第二转座酶不能识别并转座第一转座子。这是因为多核苷酸序列在基因组内的位置影响了在所述多核苷酸上编码的基因的可表达性，因此，第二转座酶将第一转座子转座到不同的染色体位置可以改变在第一异源多核苷酸上编码的任何基因的表达特性。因此，需要一组转座子及其相应的转座酶，其中该组中的转座酶仅识别和转座其相应的转座子，而不识别和转座该组中的任何其他转座子。

自1983年发现以来，来自尺蛾(looper moth)Trichoplusiani的piggyBac转座子和转座酶已被广泛用于将异源DNA插入来自许多不同生物的靶细胞的基因组中。piggyBac系统是一种特别有价值的转座酶系统，因为：“其在广泛的生物体中具有活性，其能够高效整合多个大型转基因，其能够在不损失活性的情况下向转座酶中添加结构域，且从基因组中切除而不会留下足迹突变”(Doherty et al.,Hum.Gene Ther.23,311-320(2012),于p.312,LHC,)。